microscop a y t cnicas de estudio celular n.
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MICROSCOPíA Y TÉCNICAS DE ESTUDIO CELULAR

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MICROSCOPíA Y TÉCNICAS DE ESTUDIO CELULAR. Microscopía -Resumen. Campo claro Campo Oscuro Contraste de fase Confocal Fluorescencia. Tipos de microscopios. Ópticos. Electrónicos. Transmisión Barrido. Algunos Conceptos…. Magnificación. Resolución (D). Distancia mínima a la cual

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Presentation Transcript
tipos de microscopios

Microscopía -Resumen

  • Campo claro
  • Campo Oscuro
  • Contraste de fase
  • Confocal
  • Fluorescencia
Tipos de microscopios

Ópticos

Electrónicos

  • Transmisión
  • Barrido
slide3

Algunos Conceptos…

Magnificación

Resolución (D)

Distancia mínima a la cual

el equipo puede mostrar

dos puntos como

entidades separadas

Aumento que logra el

equipo

de qu depende la resoluci n

Algunos Conceptos…

¿De qué depende la resolución?

0,5 . λ

D =

n . senθ

¿Cómo

disminuir D?

slide5

Algunos Conceptos…

¿De qué depende la resolución?

FILTRO

AZUL

λ

Longitud de onda del haz de luz

0,5 .

D =

n . senθ

slide6

Algunos Conceptos…

Objetivo

q

muestra

¿De qué depende la resolución?

λ

0,5 .

D =

senθ

n .

LENTE CON

AN MAYOR

slide7

Algunos Conceptos…

¿De qué depende la resolución?

Es el cambio de dirección que experimenta un rayo de luz cuando pasa de un medio transparente a otro también transparente. Este cambio de dirección está originado por la distinta velocidad de la luz en cada medio.

nAire: 1 nAceite:1,5

λ

0,5 .

D =

n

. senθ

Índice de refracción

ACEITE DE

INMERSIÓN

slide8

Microscopio óptico

TORNILLOS DE

REVOLVER

EL PORTAOBJETOS

slide11

Microscopio óptico – Campo oscuro

Objetos brillantes

sobre un fondo oscuro

Observar organismos

vivos sin necesidad

de tinción

aumenta peque as diferencias en el ndice de refracci n y densidad en la c lula

Microscopio óptico – Contraste de fase

sombra

luz

Aumenta pequeñas diferencias en el índice de refracción y densidad en la célula

Observar organismos

vivos sin necesidad

de tinción

El anillo forma un cono hueco de luz.

El rayo de luz que atraviese la muestra va a retrasarse respecto del rayo que siga de largo

slide15

Microscopio óptico – Contraste de fase

Células HeLa (Henrietta Lacks)

Eritrocitos Humanos

Zygnema Filamentous Algae

slide16

Microscopio óptico – Interferencia

Mismo principio que el microscopio de contraste de fase pero utiliza luz polarizada

Permite la visualización detallada sin teñir

Maximiza la diferencia entre los índices de refracción entre las partes de la muestra de forma de hacer visibles los limites celulares

slide17

Microscopio óptico – Contraste de fase e interferencia - Imágenes

Contraste

de fase

Interferencia

diferencial

los objetos pueden tambi n visualizarse por la luz que ellos mismos emiten

Microscopio óptico - Fluorescencia

Pasa sólo la λ que permite la excitación del fluorocromo

Restringe infrarrojo

Los objetos pueden también visualizarse por la luz que ellos mismos emiten
slide19

Microscopio óptico - Fluorescencia

Algunos “objetos” fluorescentes…

GFP

(Green fluorescent protein)

Aequoria victoria

slide20

Drpspphila

hela

Célula de cebolla (peroxisomas)

slide24

Microscopía electrónica

Microscopía electrónica

  • Microscopía electrónica de transmisión (TEM)

Estructura interna y detalles ultraestructurales

  • Microscopía electrónica de barrido (SEM)

Morfología y características de la superficie

slide26

Microscopía electrónica. Microscopio electrónico de transmisión (TEM)

Bacilos en división

Mitocondria 60.000x

Bacteria fagocitada por un macrófago

Herpes virus ensamblándose en el núcleo

slide28

Microscopía electrónica. Microscopio electrónico de barrido (SEM)

Glomérulo renal 1200x

Espermatozoides bovinos

Célula en corte transversal

Piel humana

slide29

Microscopía electrónica. Microscopio electrónico de barrido (SEM)

Bacterias sobre un estoma

Célula vegetal con cristales (falsa tinción)

Glób. Rojo

Glób. Blanco

slide31

Microscopía electrónica - Ventajas y desventajas

  • Elevados costos de los equipos  y una infraestructura adecuada no permiten el uso de la técnica en cualquier laboratorio.
  • Altos costos de procesamiento de las muestras
  • La manipulación de reactivos se  torna peligrosa por la elevada condición tóxica de los mismos.
  • Procesamiento tedioso de la muestra. Creación de artefactos
  • La complejidad de los equipos requiere de personal técnico especializado.
  • Proporciona resultados de amplia resolución y magnificación
slide33

Microscopía de fuerza atómica (AFM)

Imágenes AFM de fibras de colágeno (izquierda) y ADN (derecha).

Imágenes AFM de una célula viva en un medio de cultivo (izquierda) y cromosoma humano (derecha).

slide34

Microscopía de fuerza atómica (AFM)

AFM images of M13 phage and mtDNA. M13 phage genomes before (A) and after (B) binding to SSB. Clayton et al, 2006.

slide35

Técnicas inmunológicas

Introducción a las Técnicas inmunológicas

  • ELISA
  • Western blot
  • Dot blot
  • Inmunohistoquímica
  • Inmunofluorescencia
  • Citometría de flujo
slide37

Técnicas Inmunológicas - Producción de Inmunoglobulinas (anticuerpos)

Anticuerpo

Linfocito B

epitope

Activación

Antígeno

slide38

Técnicas Inmunológicas - Anticuerpos

Los antígenos suelen presentar múltiples copias del mismo epítope, y/o presencia de múltiples epítopes que son reconocidos por múltiples anticuerpos.

Antígeno

Epitope A

Epitope C

Epitope B

slide40

Técnicas Inmunológicas – Anticuerpos Policlonales

Centrifugación

Purificación

Sangre

Suero

slide41

Técnicas Inmunológicas – Anticuerpos Monoclonales

Antígeno

Cultivo de células

tumorales

Sangrado

+

Purificación de

Linfocitos B

Fusión

Hibridoma

slide42

Técnicas Inmunológicas – Anticuerpos Monoclonales

Hibridomas

Screening: Búsqueda de hibridoma positivo y aislamiento

Purificación de anticuerpos monoclonales del sobrenadante de cultivo de los hibridomas

slide43

Técnica de enzimoinmunoensayo (ELISA)

Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)

Para detectar

Antígenos

Anticuerpos

slide44

ELISA

ELISA Para detectar Anticuerpos

Sensibilización

Bloqueo

Incubación con Suero

slide45

ELISA

ELISA Para detectar Anticuerpos

Lavado

Anticuerpo 2º

Revelado

slide46

ELISA

ELISA Para detectar Antígenos

Sensibilización

Bloqueo

Incubación con Suero

slide47

ELISA

ELISA Para detectar Anticuerpos

Lavado

Anticuerpo 2º

Revelado

slide48

Revelado – Detección Indirecta

Revelado:

Complejo biotina-avidina

slide49

Revelado – Detección indirecta

Antígeno

Ac. primario

Ac. secundario

Biotina

Avidina

Peroxidasa

Cromógeno

Cromóforo

slide50

Revelado – Detección indirecta

Formación de colores por la acción enzimática de distintos cromógenos

slide51

Ventajas ELISA

  • Muy sensible
  • Gran número de muestras procesadas simultáneamente
  • Resultados rápidos
  • Cuantificación de sustancias diversas (hormonas, fármacos, etc.)
slide52

Western blot

Western blot: identificación de proteínas

SDS - PAGE

Incubación con Ab y revelado

Transferencia

Membrana

Gel

Transferencia

slide53

Western blot

Bloqueo

Anticuerpo 1º

Anticuerpo 2º

biotinilado

Biotina-avidina + peroxidasa

Revelado

  • Sustrato coloreado que precipita al reaccionar
  • Sustrato que emite luz al reaccionar con la enzima (revelado en placa radiográfica)
slide54

Ejemplo Western blot

Gel acrilamida

Membrana nitrocelulosa

Placas radiográficas

DAT

Actina

250

160

105

75

50

slide55

Dot blot

  • Variante de las técnicas de Southern, Northern y Western blot

DOT BLOT

  • Identificación de moléculas

Dot blot analysis of proteins extracted from wild-type spores and from spores exposing a TTFC chimera. (Ricca and Cutting. Journal of Nanobiotechnology 2003 1:6)

slide56

Inmunohistoquímica

Inmunohistoquímica: identificación en el tejido

Se corta en secciones muy finas y se coloca en un portaobjetos

Trozo de tejido

Anticuerpo 1º

Anticuerpo 2º

biotinilado

Avidina-peroxidasa

Revelado

slide57

Inmunohistoquímica - Revelado

Anti MMP-13 revelado con DAB

Contratinción hematoxilina

slide59

Inmunofluorescencia

Ficoeritrina

Fluoresceina

Rodamina

DAPI

Naranja

de Acridina

Bromuro

de Etidio

slide60

Inmunofluorescencia

N-myc/CD56

Rat neurons

slide61

Inmunofluorescencia-colocalización

La colocalización permite determinar si dos antígenos se encuentran en el mismo lugar (nucleo, vacuola, retículo, etc) dentro de una célula

slide63

Citometría de Flujo

Citometría de Flujo

Célula

Medida

En movimiento

Medida de las propiedades de las células mientras están en un flujo de líquido

  • Inmunophenotipificación
  • Viabilidad/apoptosis/Proliferación
  • Ciclo celular
  • Cambios en la superficie
  • Actividad enzimática
  • etc
slide64

Citometría de Flujo

Marcación con anticuerpos monoclonales

Mezcla de células

slide65

Citometría de Flujo

La presión ejercida por una columna de fluido obliga a las células a “enfilarse” de a una

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Citometría de Flujo

Columna de células

slide68

Citometría de Flujo

La luz que se detecta a 90 grados del haz del laser (side) es detectada por el canal Side Scatter Channel (SSC)

La intensidad de la señal es proporcional a la cantidad de estructuras citosólicas en la célula (gránulos, inclusiones, etc)

Granularidad

Tamaño

La luz que se detecta en la misma dirección del laser (forward) es detectada por el canal Forward Scatter Channel (FSC).

La intensidad de la señal detectada se relaciona con el tamaño, y el indice de refracción de las células

slide71

Fluorescencia -Técnicas - Citometría de Flujo

Ejemplo:

Selección del sexo a través de citometría de flujo de espermatozoides