MICROSCOPíA Y TÉCNICAS DE ESTUDIO CELULAR

1. MICROSCOPíA Y TÉCNICAS DE ESTUDIO CELULAR

2. Microscopía -Resumen • Campo claro • Campo Oscuro • Contraste de fase • Confocal • Fluorescencia Tipos de microscopios Ópticos Electrónicos • Transmisión • Barrido

3. Algunos Conceptos… Magnificación Resolución (D) Distancia mínima a la cual el equipo puede mostrar dos puntos como entidades separadas Aumento que logra el equipo

4. Algunos Conceptos… ¿De qué depende la resolución? 0,5 . λ D = n . senθ ¿Cómo disminuir D?

5. Algunos Conceptos… ¿De qué depende la resolución? FILTRO AZUL λ Longitud de onda del haz de luz 0,5 . D = n . senθ

6. Algunos Conceptos… Objetivo q muestra ¿De qué depende la resolución? λ 0,5 . D = senθ n . LENTE CON AN MAYOR

7. Algunos Conceptos… ¿De qué depende la resolución? Es el cambio de dirección que experimenta un rayo de luz cuando pasa de un medio transparente a otro también transparente. Este cambio de dirección está originado por la distinta velocidad de la luz en cada medio. nAire: 1 nAceite:1,5 λ 0,5 . D = n . senθ Índice de refracción ACEITE DE INMERSIÓN

8. Microscopio óptico TORNILLOS DE REVOLVER EL PORTAOBJETOS

9. Microscopio óptico

10. Microscopio óptico - Campo claro - imágenes Eosinofilia

11. Microscopio óptico – Campo oscuro Objetos brillantes sobre un fondo oscuro Observar organismos vivos sin necesidad de tinción

12. Microscopio óptico – Campo oscuro - Imágenes Treponema pallidum

13. Microscopio óptico – Contraste de fase sombra luz Aumenta pequeñas diferencias en el índice de refracción y densidad en la célula Observar organismos vivos sin necesidad de tinción El anillo forma un cono hueco de luz. El rayo de luz que atraviese la muestra va a retrasarse respecto del rayo que siga de largo

14. Microscopio óptico – Contraste de fase

15. Microscopio óptico – Contraste de fase Células HeLa (Henrietta Lacks) Eritrocitos Humanos Zygnema Filamentous Algae

16. Microscopio óptico – Interferencia Mismo principio que el microscopio de contraste de fase pero utiliza luz polarizada Permite la visualización detallada sin teñir Maximiza la diferencia entre los índices de refracción entre las partes de la muestra de forma de hacer visibles los limites celulares

17. Microscopio óptico – Contraste de fase e interferencia - Imágenes Contraste de fase Interferencia diferencial

18. Microscopio óptico - Fluorescencia Pasa sólo la λ que permite la excitación del fluorocromo Restringe infrarrojo Los objetos pueden también visualizarse por la luz que ellos mismos emiten

19. Microscopio óptico - Fluorescencia Algunos “objetos” fluorescentes… GFP (Green fluorescent protein) Aequoria victoria

20. Drpspphila hela Célula de cebolla (peroxisomas)

21. Microscopio óptico - Fluorescencia - Confocal

22. Microscopio óptico - Fluorescencia - Confocal

23. Microscopio óptico - Fluorescencia - Confocal

24. Microscopía electrónica Microscopía electrónica • Microscopía electrónica de transmisión (TEM) Estructura interna y detalles ultraestructurales • Microscopía electrónica de barrido (SEM) Morfología y características de la superficie

25. Microscopía electrónica - Microscopio electrónico de transmisión (TEM)

26. Microscopía electrónica. Microscopio electrónico de transmisión (TEM) Bacilos en división Mitocondria 60.000x Bacteria fagocitada por un macrófago Herpes virus ensamblándose en el núcleo

27. Microscopía electrónica. Microscopio electrónico de barrido (SEM)

28. Microscopía electrónica. Microscopio electrónico de barrido (SEM) Glomérulo renal 1200x Espermatozoides bovinos Célula en corte transversal Piel humana

29. Microscopía electrónica. Microscopio electrónico de barrido (SEM) Bacterias sobre un estoma Célula vegetal con cristales (falsa tinción) Glób. Rojo Glób. Blanco

30. Microscopía óptica vs. electrónica

31. Microscopía electrónica - Ventajas y desventajas • Elevados costos de los equipos  y una infraestructura adecuada no permiten el uso de la técnica en cualquier laboratorio. • Altos costos de procesamiento de las muestras • La manipulación de reactivos se  torna peligrosa por la elevada condición tóxica de los mismos. • Procesamiento tedioso de la muestra. Creación de artefactos • La complejidad de los equipos requiere de personal técnico especializado. • Proporciona resultados de amplia resolución y magnificación

32. Microscopía de fuerza atómica (AFM)

33. Microscopía de fuerza atómica (AFM) Imágenes AFM de fibras de colágeno (izquierda) y ADN (derecha). Imágenes AFM de una célula viva en un medio de cultivo (izquierda) y cromosoma humano (derecha).

34. Microscopía de fuerza atómica (AFM) AFM images of M13 phage and mtDNA. M13 phage genomes before (A) and after (B) binding to SSB. Clayton et al, 2006.

35. Técnicas inmunológicas Introducción a las Técnicas inmunológicas • ELISA • Western blot • Dot blot • Inmunohistoquímica • Inmunofluorescencia • Citometría de flujo

36. Técnicas Inmunológicas - Inmunoglobulinas

37. Técnicas Inmunológicas - Producción de Inmunoglobulinas (anticuerpos) Anticuerpo Linfocito B epitope Activación Antígeno

38. Técnicas Inmunológicas - Anticuerpos Los antígenos suelen presentar múltiples copias del mismo epítope, y/o presencia de múltiples epítopes que son reconocidos por múltiples anticuerpos. Antígeno Epitope A Epitope C Epitope B

39. Técnicas Inmunológicas – Anticuerpos Policlonales Antigeno Activación Linfocitos B

40. Técnicas Inmunológicas – Anticuerpos Policlonales Centrifugación Purificación Sangre Suero

41. Técnicas Inmunológicas – Anticuerpos Monoclonales Antígeno Cultivo de células tumorales Sangrado + Purificación de Linfocitos B Fusión Hibridoma

42. Técnicas Inmunológicas – Anticuerpos Monoclonales Hibridomas Screening: Búsqueda de hibridoma positivo y aislamiento Purificación de anticuerpos monoclonales del sobrenadante de cultivo de los hibridomas

43. Técnica de enzimoinmunoensayo (ELISA) Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) Para detectar Antígenos Anticuerpos

44. ELISA ELISA Para detectar Anticuerpos Sensibilización Bloqueo Incubación con Suero

45. ELISA ELISA Para detectar Anticuerpos Lavado Anticuerpo 2º Revelado

46. ELISA ELISA Para detectar Antígenos Sensibilización Bloqueo Incubación con Suero

47. ELISA ELISA Para detectar Anticuerpos Lavado Anticuerpo 2º Revelado

48. Revelado – Detección Indirecta Revelado: Complejo biotina-avidina

49. Revelado – Detección indirecta Antígeno Ac. primario Ac. secundario Biotina Avidina Peroxidasa Cromógeno Cromóforo

50. Revelado – Detección indirecta Formación de colores por la acción enzimática de distintos cromógenos