Možnosti kontroly identity lesného reprodukčného materiálu genetickými metódami

1. Možnosti kontroly identity lesného reprodukčného materiálu genetickými metódami Monika Konnert Bayerisches Amt für forstliche Saat- und Pflanzenzucht, Teisendorf Elena Foffová Národné lesnícke centrum, Stredisko kontroly lesného reprodukčného materiálu, Liptovský Hrádok Vladimír Foff LIA - Lesnícka informačná agentúra, Liptovský Hrádok

3. Ako sa dá zabezpečiť identita lesného reprodukčného materiálu? • legislatívnymi predpismi (zákon 217/2004, vyhláška 571/2004)akontrolami produkcie a dokladov (potvrdenie pôvodu, sprievodné listy) • analýzou a porovnaním genetických informácií

4. ASP Teisendorfv rokoch 1992-1999 riešilasi 50 kontrolných prípadov pomocou biochemicko-genetických analýz (dreviny: BK, JH, SM, JD, DB, LP, BO, SC) Dôvod: Pochybnosti o pôvode nakúpeného sadbového materiálu Problém: Obvykle chýbal vhodný porovnávací (referenčný) materiál Výsledok: Nedostatočná istota výpovedí – len domnienky Záver z r. 1999: „Ak sa majú biochemicko-genetické metódy naďalej využívať ako nástroj pri kontrole identity LRM, je nevyhnutne nutné zabezpečiť vhodné referenčné vzorky od doby zberu cez jednotlivé stupne produkcie LRM“

5. Zber semennej suroviny Spracovaniesemennej suroviny Miešanie oddielov osiva Výroba sadbového materiálu Ref. vzorka R1 reprezentatívna zmes Ref. vzorka R2 z jednotlivých stromov* Ref. vzorka R3 reprezentatívnavzorka zo spracovaného osiva Ref. vzorka R4 reprezentatívnavzorka zo zmesi Vzorka sadb. materiálu P podľa potreby Testovanie osiva Biochemicko-genetická analýzaalebo molekulárno-genetickáanalýzaaporovnanie genetických charakteristík Odhad maximálnehomnožstva sadbového materiálu z daného zberu Potvrdenie identity

6. Referenčné vzorky sú pre kontrolu identity lesného reprodukčného materiálu použiteľné vtedy, ak: • pri spracovaní a skladovaní osiva a pri pestovaní sadbového materiálu nedochádza k selektívnym procesom, ktoré by preukázateľne zmenili genetickú štruktúru pôvodného oddielu; • je možný odber reprezentatívnych vzoriek náhodným výberom, hlavne v prípade, že sa jedná o väčšie a nie vždy homogénne oddiely semien alebo sadbového materiálu; • sú k dispozícii štandardizované metódy analýzy genetickej štruktúry; • genetické rozdiely medzi rôznymi oddielmi zozbieraných semien sú preukázateľne väčšie ako rozdiely medzi vzorkami z rôznych štádií spracovania alebo pestovania toho istého oddielu.

7. Typy markerov vhodné pre overenie identity LRM Izoenzýmové markery Pre mnoho drevín, na ktoré sa vzťahujú európske legislatívne predpisy, sú k dispozícii štandardizované metódy reprezentatívneho odberu vzoriek ako aj ich biochemicko-genetickej analýzy (Konnert 2004). Pri drevinách ako je buk, javor horský, lipa malolistá, jelša lepkavá, duby, jaseň, jedľa, smrek, smrekovec a duglaska, sa prejavujú aj dostatočne veľké genetické rozdiely medzi rôznymi oddielmi. DNA- markery hlavne mikrosatelity jadrovej a chloroplastovej DNA. Využiteľné napríklad na genetickú identifikáciu stromov, tvoriacich porast, z ktorých boli zbierané semená a neskôr na identifikáciu tých semien alebo semenáčikov, ktoré z deklarovaného zdroja a materských stromov nemôžu pochádzať.

8. Praktické príklady Pre ilustráciu možností využitia referenčných vzoriek a genetických analýz na overenie identity lesného reprodukčného materiálu uvádzame štyri príklady z praxe Bavorského úradu pre lesné osivo a sadbový materiál v Teisendorfe.

9. 1. Overenie identity sadeníc smrekovca na vylepšenie ochranného lesa v Alpách • dodávka zmluvne pestovaných sadeníc z osiva dodaného zákazníkom • z použitého osiva bola pri zbere odložená referenčná vzorka - R1 • Z dodaných sadeníc boli odobraté púčiky- P Referenčné vzorky umožnili porovnať genetické rozdiely medzi osivom a dopestovaným materiálom izoenzýmovou analýzou.

10. Výsledky: Systém PGM Semená Dodané sadenice Semená Dodané sadenice Semená Systém SKDH Semená Dodané sadenice Dodané sadenice

11. Záver: Analyzovaný oddiel smrekovcových sadeníc nepochádza z deklarovaného osiva. K dispozícii sú aj údaje o množstve a kvalite použitého osiva, ktoré jednoznačne podporujú výsledok izoenzýmových analýz: • na zmluvné pestovanie bolo odovzdané 600 g osivas klíčivosťou 15% • počet klíčivých semien v 1 kg osiva predstavoval 20 000 ks • v 600 g osivamohlo byť maximálne 12000klíčivých semien • dodaných bolo 8000 preškôlkovaných sadeníc (1+1), Výborná využiteľnosť osiva !!! Selekcia nemôže byť v takom prípade príčinou zistených rozdielov medzi genetickou štruktúrou osiva a sadeníc.

12. 2. Overenieidentity dodávky semenáčikov buka pre certifikačný systém „ZüF“ Referenčné vzorky: vzorka rastlinného materiálu P (odobratá pri vyzdvihovaní) porovnanásreferenčnou vzorkou osiva R1 (odobratá pri zbere) Metodika: izoenzýmová analýza – 12 lokusov, 130 semenáčikov a 150 semien Výsledok:Genetická vzdialenosťDallelická= 2,7 %, Ggenotypová= 5,8 % rozdiely nie sú štatisticky významné Výsledok overenia identity je v zmysle postupu „ZüF“ pre tento odiel semenáčikov pozitívny.

13. 3. Overenieidentity sadeníc javora horského Referenčné vzorky: vzorka rastlinného materiálu P (odobratá pri vyzdvihovaní) porovnanás referenčnou vzorkou osiva R1 (odobratá pri zbere) a referenčnou vzorkou osiva R3 (odobratá po spracovaní/čistení) Metodika: izoenzýmová analýza – 12 lokusov, 130 semenáčikov a 150 semien Výsledok: Výsledok overenia je negatívny, oddiel sadeníc nepochádza z deklarovaného oddielu semien.

14. 4. Priradenie sadeníc k materským stromom (klonom) javora horského po analýze jadrovej a chloroplastovej DNA Semenáčiky 15, 29 a 38 majú na lokuse MAP33 len alelu 152. To znamená, že môžu pochádzať len z tých klonov, ktoré majú túto alelu v homozygotnej alebo heterozygotnej forme. Spomedzi stromov, z ktorých sa uskutočnil zber v semennom sade, to môžu byť len klony A, B, C. Ak vezmeme do úvahy aj lokusy MAP2 a MAP 12, zistíme, že semenáčiky 15 a 29 nemohli pochádzať ani z jedného z uvedených troch klonov, pretože nemajú na týchto lokusoch vždy aspoň jednu alelu rovnakú ako materské stromy. Semenáčik číslo 38 mohol pochádzať z klonu A. Touto metódou sa potvrdilo, že cca. 20% semenáčikov nepochádzalo z deklarovaného oddielu semien.

15. Využitie v praxi Certifikačná schéma pre lesný reprodukčný materiál s overiteľným pôvodom je už do praxe uvedená v južnom Nemecku (Bavorsku a Bádensku-Würtembersku). Realizáciu schémy zabezpečuje súkromné Združenie pre kontrolovateľný pôvod lesného reprodukčného materiálu - ZüF, ktoré vzniklo na jar v roku 2002. Členom združenia sa môže stať, ktorýkoľvek záujemca registrovaný v Národnom registri producentov lesného reprodukčného materiálu, ale členstvo nie je pre účasť v certifikačnej schéme povinné. Účastníci, ktorí nie sú členmi združenia platia vyššie poplatky za certifikáty. Zúčastnení pestovatelia predávajú svoje sadenice s „Certifikátom reprodukčného materiálu s overiteľným pôvodom“. Uvádzajú teda na trh „prémiový produkt“ pri ktorom treba počítať s približne o 10% vyššou cenou ako pri „obyčajnom“ reprodukčnom materiáli. Záujem o prístup k tejto certifikačnej schéme podporuje i skutočnosť, že certifikačný systém lesov PEFC Deutschland v revidovaných Normách PEFC pre Nemecko požaduje kontrolu pôvodu použitého osiva a sadbového materiálu podľa odborne uznávaných a vhodných postupov.

16. Association Association Advisory Advisory Board Board ( ( open open membership membership ) ) Participant Participant issue issue of of ( ( company company ) ) ID ID - - number number nomination nomination Organization Organization Agency Agency information information Service Service Agencies Agencies - - Yield Yield contract contract certificate certificate - - Storage Storage - Genetic Tests - Genetic Tests information information certified certified Certification Certification Agency Agency ( ( seeds seeds ) ) plants plants ( ( free free access access to to any any field field contract contract related related to to Certification Certification Scheme Scheme at time of at time of certification certification ) ) User User Organizácia certifikačnej schémy

17. Záver: • Spoľahlivosť kontrolných analýz sa zvyšuje a náklady na analýzy sa dajú optimalizovať kombináciou rôznych metód. • Pre overovanie pôvodu sú potrebné reprezentatívne referenčné vzorky odobraté na dôležitých miestach výrobného procesu lesného reprodukčného materiálu. • Možnosti overovania pôvodu lesného reprodukčného materiálu s využitím biochemických a molekulárnych metód genetickej analýzy drevín sa neustále vyvíjajú. • Pri niektorých druhoch drevín je naliehavo potrebný základný výskum (vývoj markerov). Súčasný stav štandardizácie metodík odberu a analýzy vzoriek vytvára reálnu možnosť využívať genetické metódy na overenie deklarovaného pôvodu lesného reprodukčného materiálu v oveľa väčšom rozsahu ako sa doteraz dalo predpokladať. V Nemecku sa už používajú pri certifikácii sadbového materiálu s overiteľným pôvodom a v Rakúsku sú súčasťou legislatívne stanovených kontrolných opatrení.