analisi di biomolecole n.
Download
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
ANALISI DI BIOMOLECOLE PowerPoint Presentation
Download Presentation
ANALISI DI BIOMOLECOLE

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 38

ANALISI DI BIOMOLECOLE - PowerPoint PPT Presentation


  • 288 Views
  • Uploaded on

ANALISI DI BIOMOLECOLE. PROTEINE E AMINOACIDI. Determinazione della struttura primaria. HCl 6N. proteina. Amino acidi. 110°C 24-72 ore. In queste condizioni drastiche alcuni amino acidi, come cisteina, triptofano Asparagina, glutamina vengono distrutti Accorgimenti specifici.

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about 'ANALISI DI BIOMOLECOLE' - starbuck


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
proteine e aminoacidi
PROTEINE E AMINOACIDI

Determinazione della struttura primaria

HCl 6N

proteina

Amino acidi

110°C

24-72 ore

In queste condizioni drastiche alcuni amino acidi, come cisteina, triptofano

Asparagina, glutamina vengono distrutti

Accorgimenti specifici

slide3

Separazione e quantificazione degli amino acidi nell’idrolizzato

derivatizzazione

1-Dopo 2-Prima

separazione

slide4

1-Derivatizzazione dopo separazione:

-separazione su colonna a scambio ionico

-reazione con ninidrina

slide5

Gli amino acidi vengono fatti ragire a 100°C con la ninidrina

Si formano derivati colorati che vengono letti a 570 nm

slide6

2-Derivatizzazione prima della seprazione

-Reazione con dansil cloruro

fenilisotiocianato

o-ftaldeide

-Separazione su HPLC

determinazione della struttura primaria
Determinazione della struttura primaria
  • Metodo chimico
    • Degradazione di Edman
  • Metodo basato sul DNA ricombinante
slide11

Tappe sequenziali

  • Analisi sequenziale della porzione N-terminale della proteina
  • 2) Scissione della proteina in peptidi, mediante proteolisi chimiche o enzimatiche
  • metodi enzimatici:
  • tripsina
  • chimotripsina
  • proteasi A
  • proteasi V8
  • metodi chimici:
  • BrCN
  • 3) Separazione dei peptidi ottenuti
  • 4) Analisi degli amminoacidi di ciascun peptide
  • 5) Analisi sequenziale di ciascun peptide (Edman)
  • 6) Allineamento dei peptidi
slide12

Polypeptide Fragmentation

Cleavage by Endopeptidases

Rn-1

Rn

O

O

C

NH

CH

NH

CH

C

scissile

peptide bond

Specificity:

Enzyme:

Trypsin Rn-1 = Arg or Lys (positively charged side chains)

Rn≠ Pro

(highly specific enzyme; most useful)

Chymotrypsin Rn-1 = Phe or Trp or Tyr

Rn≠ Pro

slide14

N

C

N

C

C

N

C

N

trypsin

trypsin

trypsin

trypsin

chymotrypsin

chymotrypsin

chymotrypsin

CNBr

CNBr

informazioni sulla proteina ottenuta
Informazioni sulla proteina ottenuta
  • Confronto con le altre proteine conosciute
  • Confronto con la stessa proteina in specie diverse
  • Sequenze per la localizzazione cellulare
  • Ipotesi sulla struttura secondaria
  • Sito attivo e mutazioni
  • Sintesi sonde oligonucletidiche
struttura secondaria e terziaria
Struttura secondaria e terziaria
  • Molto difficoltosa
  • Molto importante il contributo della tecnologia del DNA ricombinante
  • Metodi
    • spettrofluorimetria
    • Dicroismo circolare
    • NMR
    • Cristallografia ai raggi X
slide17

5) Spettrofluorimetria

La fluorescenza è un fenomeno di emissione.

La transizione di energia da uno stato più alto ad uno più basso è accompagnata da una emissione di radiazione piuttosto che assorbimento.

Affinchè ciò avvenga deve prima avvenire un evento di eccitazione, ad es. causato da assorbimento di radiazione elettromagnetica.

La l della radiazione di assorbimento deve essere più bassa

(energia più alta) di quella emessa (fluorescenza). La differenza di queste due l è nota come “shift di stokes”.

E’ possibile per un composto assorbire (o essere eccitato) nel

UV ed emettere (o fluorescere) nel visibile.

Fosforescenza, simile ma l’emissione ha un tempo di decadi-

mento più lungo e persiste anche quando l’eccitazione è terminata. L’emissione della luce avviene a l maggiori della fluorescenza.

slide18
Il meccanismo di diseccitazione con emissione di un fotone è quello che accade in fluorescenza.
  • Le proteine sono macromolecole facilmente studiabili con la tecnica della spettrofluorimetria in cui la lunghezza d'onda dell'energia emessa è maggiore della lunghezza d'onda dell'energia assorbita. L’aumento di lunghezza d'onda è chiamato spostamento o shift di Stokes.
  • Poiché un quanto è pari all'energia necessaria per permettere il salto di un elettrone, l'efficienza quantica Q è il rapporto tra i quanti emessi per fluorescenza e i quanti assorbiti ed è indipendente dalla lunghezza d'onda della luce di eccitamento.
  • A basse concentrazioni, vale la relazione seguente tra l'intensità di fluorescenza If e la radiazione incidente Io:

If  = Io 2,3 el c d Q

dove c=concentrazione molare del composto fluorescente; d=cammino ottico, in cm, della soluzione fluorescente; e= coefficiente di estinzione molare del composto che assorbe alla lunghezza d'onda l

slide20

La tecnica della spettrofluorimetria è accurata a basse

concentrazioni dove la spettrofotometria non lo è.

100 pg catecolamine spettrofluorimetria

100 mg catecolamine spettroscopia

Selettività spettrale

Strumentazione:

due monocromatori

controllo T

E’ influenzata dal pH, temperatura, polarità del solvente ma

soprattutto dal “quenching” -----> la luce emessa viene persa

per collisione con altre molecole ====> bassa concentrazione

slide21

Applicazioni

Molte anche se pochi composti manifestano questo fenomeno.

Il rilevamento di un composto non fluorescente può essere

ottenuto legandolo ad un probe fluorescente (fluorescenza

estrinseca). Se invece il composto nativo ha fluorescenza

(fluorescenza intrinseca).

aa legati tramite il gruppo -NH2 a cloruro di dansile

acridina orange dà coniugati diversi con DNA ss e ds.

L’utilizzo maggiore è la determinazione di sostanze presenti in scarsa quantità:

vitamina B1 nel cibo, NADH, ormoni, droghe, pesticidi,

carcinogeni,…..

slide23

Spettrofluorimetria e studio del folding di una proteina

  • La fluorescenza è diversa a seconda dell’ambiente più o meno polare dell’ambiente proteico in cui si trovano e risente dell’effetto quenching creato dall’interazione con altre molecole o altre struttura chimiche delle proteine (ponti disolfuro)
  • Le fluorescenze sono diverse a seconda che conservino la struttura terziaria o no
  • La denaturazione comporta un allungamento dello shift di Stokes e del cambiamento di intensità dello spettro di emissione
  • Abbiamo spettri caratteristici dello stato folded che unfolded
  • E’ possibile calcolare la % di proteina nei due stati
slide24

fu = (yf - y) / (yf - yu) fu: frazione unfolded; yf : fluorescenza della proteina folded; yu: fluorescenza della proteina unfolded

Y: fluorescenza del campione ad una particolare concentrazione di denaturante

slide25

Spettroscopia in dicroismo circolare (CD)

Questo tipo di spettroscopia sfrutta la capacità degli isomeri ottici di ruotare il piano della luce polarizzata. La luce può essere polarizzata in modo da selezionare le onde elettromagnetiche che oscillano su uno stesso piano mediante il passaggio

della luce attraverso uno schermo polarizzante o un prisma di Nicol.

La radiazione polarizzata in un piano

corrisponde alla sovrapposizione di

onde polarizzate circolarmente a destra e a sinistra della stessa intensità.

slide26

Se le due onde polarizzate circolarmente

a destra e a sinistra hanno intensità

diversa, la radiazione derivante dalla

loro somma è polarizzata ellitticamente.

Questa tecnica permette di misurare la variazione dell'angolo di polarizzazione dopo che la luce ha attraversato una sostanza chirale (otticamente attiva).

Entrando in un materiale che assorbe

differentemente la radiazione

circolarmente polarizzata a destra e

quella circolarmente polarizzata a

sinistra, la luce incidente, polarizzata nel piano, esce polarizzata ellitticamente.

L'ellitticità q è il parametro che viene misurato nella spettroscopia CD ed è dato da:

q = 2.303 DE (180/4 p) = 33 DE gradi DE è dato dalla differenza tra le componenti R ed L.

slide27

APPLICAZIONI

  • La principale è lo studio della conformazione delle macromolecole biologiche che si
  • integra con dati di NMR.
  • PROTEINE
  • Si possono avere informazioni sulla proporzione relativa delle strutture secondarie (a eliche, foglietti b) presenti in una proteina in soluzione.
  • Nelle regioni del cosiddetto near UV si possono identificare picchi che derivano dal contributo alla rotazione della luce polarizzata fornito da residui di triptofano (intorno a 290 nm) di Phe e Tyr intorno a 280 nm e del disolfuro intorno a 270 nm.
  • - Determinazione della struttura secondaria di una proteina
  • Studio dell’effetto del legame di farmaci sulle proteine
  • Folding /denaturazione delle proteine
  • Studio di interazione proteina-proteina e proteina-DNA
slide29

Gli spettri CD possono essere interessanti per:

- distinguere B, A e Z DNA;

- studiare variazioni della struttura causate da modificazione del pH, della forza ionica o anche dall'interazione con DNA binding proteins.

Circular dichroism spectroscopy of HMGI-C binding to DNA. Near-UV CD spectrum of 2 mM double-stranded CAnt1 oligonucleotide +/- 2 mM HMGI-C (1:1 molar ratio). The ellipticity values are given in terms of the molar concentration of oligonucleotides. The solid line represents the oligonucleotide alone, while the dashed line represents the oligonucleotide plus protein.

slide30

7. Turbidometria e nefelometria

Utilizzate per determinare la concentrazione di sospensioni diluite.

Nella turbidometria viene misurato l’assorbimento apparente della radiazione quando attraversa la sospensione. La legge di Lambert e Beer non è applicabile .

Non avviene assorbimento ma fenomeni di dispersione in cui la luce è diffratta dalle particelle sospese. Si usa sempre lo spettrofotometro.

APPLICAZIONI

Misura di sospensioni di microrganismi (batteri, lievito) lettura a 600 nm.

slide31

Cristallografia ai raggi X

Sono necessari cristalli di proteina

Componenti di una determinazione cristallografica

slide32

-La deviazione è proporzionale al numero di elettroni

-Le onde diffratte si rinforzano l’un l’altra se sono in fase o si si cancellano

se sono fuori fase

-La ricombinazione delle onde diffratte dipende dalla disposizione degli atomi

lipidi
Lipidi
  • relativa insolubilità in acqua
  • estrazione con solventi organici: acetone, etere, cloroformio in diversi rapporti tra loro.
  • E’ possibile estrarre selettivamente alcune classi di lipidi. Solventi non polari, come esano, etere, cloroformio permettono l’estrazione di lipidi neutri da tessuti adiposi.
  • I lipidi di membrana richiedo solventi più polari metanolo ed etanolo. Utilizzati sono anche i metodi cromatografici: cromatografia di adsorbimento e cromatografia su strato sottile.
slide35

Misurazione del glicerolo

I trigliceridi possono essere determinati misurando il glicerolo

rilasciato dopo idrolisi seguita da una reazione enzimatica accoppiata (test ottico accoppiato):

triacilglicerolo glicerolo + acidi grassi

slide36

Misurazione del colesterolo

Il colesterolo viene determinato per reazione enzimatica con colesterolo ossidasi.

L’acqua ossigenata liberata può essere determinata colorimetricamente:

estrazione dna ed rna
Estrazione DNA ed RNA
  • Lisi cellulare
  • Rimozione delle proteine (estrazione organica fenolo/cloroformio equilibrata a pH acido o neutro)
  • Precipitazione acidi nucleici con etanolo
  • Separazione DNA/RNA (centrifugazione)
slide38

pH neutro o alcalino

pH acido

Fase acquosa ( RNA)

Fase acquosa (DNA e RNA)

Interfaccia

(proteine denaturate)

Interfaccia

(proteine denaturate)

Fase fenolica

(proteine solubili e DNA)

Fase fenolica (proteine solubili)

.

Importanza del pH della saturazione del fenolo