Biochimie appliquée

1. Université Dr. Moulay Tahar de SAIDA Biochimie appliquée II- Biochimie des substances d’origine animale (2) Préparé par: Mr. HALLA Noureddine

2. Culture de cellules animales (eucaryotes): • Le cycle cellulaire et les moyens d'études

3. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Introduction Culture de cellules animales leur placement ultérieur dans un environnement artificiel récipients de cultures appropriés contenant un milieu liquide ou semisolide le prélèvement de cellules, tissus ou organes d'un animal ou d'une plante qui apporte les nutriments essentiels à la survie et à la croissance.

4. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Introduction Différentes sources • Insectes Poissons • Mammifères Humains

5. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Introduction Différents types • Épithéliales/endothéliales (membranes) • Fibroblastes • (tissus connectifs) • Myoblastes (muscles) • Neurones (syst. nerveux) • Hépatocytes (foie) • Erythrocytes (sang) • Lymphocytes • (syst. immunitaire)

6. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Introduction Différents types • Culture primaire: Culture initiale de cellules qui viennent d’être prélevées d’un tissu. Différenciée. Généralement à attachement obligatoire (ADC). • Culture secondaire: Propagation d’une culture primaire. Création d’une lignée cellulaire. Peut être cultivé en suspension. Peut être indifférencié. Durée de vie limitée (30-50 divisions). • Lignée immortelle ou stable. Lignée cellulaire transformée. Peut être cultivée en suspension. Durée de vie illimitée.

7. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Introduction Différents types

8. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Introduction Evolution des cellules en culture Courbe de croissance d'une population cellulaire A partir du premier repiquage on parle de lignée cellulaire les cellules viables se fixent sur le support alors que les mortes restent dans le milieu de culture

9. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Introduction Evolution des cellules en culture Longévité d'une culture cellulaire • On rencontre 2 cas : 1 2 • - Cultures normales ou définies : les cellules ne se multiplient que pendant un nombre limité de générations (30 à 50 repiquages) puis meurent : leur vie et leur mort est programmée. • On observe alors une diminution de leur vitesse de prolifération, phase de sénescence. • - Culture continue ou lignées transformées ou immortelles. La vitesse de multiplication ne diminue pas, ce qui permet un nombre de repiquage indéfini. Ces cellules adhérentes perdent leur besoin d'ancrage et peuvent être cultivées en suspension.

10. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Introduction Cellules transformées Naturelles • Virales • Chimiques immortalisées spontanément in vitro - mutées pour des gènes impliqués dans la régulation du cycle cellulaire (comme par exemple la protéine p53). transformées artificiellement par un virus oncogène (c.à.d. un gène immortalisant tel que T de SV40)

11. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Introduction • Différentes lignées MRC5, W138 HeLa CHO Vero Sf9 293 reins de singe verts africains, stable, adhérente, versatile secondaires, fibroblastes, poumons humains, adhérentes, vaccins Spodopterafrugiperda, stable, système d’expression baculovirus cancer cervical humain (Helen La...), stable, adhérentes, recherche ovaire de hamster chinois, stable, adhérente/suspension, versatile embryon de rein humain, transformée par fragment d’adénovirus, stable, hôte d’adénovirus, adaptée à la suspension (293S)

12. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Introduction Caractéristiques générales Capable d’exocytose Ne sécrète pas d’enzymes Modifications post-traductionnelles Introns/épissage (splicing)

13. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Introduction À quoi servent les cultures de cellules? pour étudier : Systèmes de modèles La biologie et la biochimie cellulaires de base, 1 les interactions entre les cellules et les agents induisant des maladies, 2 les effets des médicaments sur les cellules, 3 Le processus et le déclenchement du vieillissement 4 5 les études nutritionnelles.

14. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Introduction À quoi servent les cultures de cellules? Systèmes de modèles Tests de toxicité pour étudier les effets de nouveaux médicaments, cosmétiques et produits chimiques sur la survie et la croissance d'une grande variété de types de cellules.

15. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Introduction À quoi servent les cultures de cellules? Systèmes de modèles Tests de toxicité Recherche sur le cancer Les cellules normales et les cellules cancéreuses pouvant toutes deux être cultivées. De plus, il est possible, en utilisant des produits chimiques, virus et rayonnements, de convertir les cellules cultivées normales en cellules cancéreuses.

16. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Introduction À quoi servent les cultures de cellules? Systèmes de modèles Tests de toxicité • la réplication de virus dans les cultures cellulaires (à la place des animaux) pour les utiliser dans la production de vaccins. Recherche sur le cancer Virologie • en détection clinique et isolement de virus, • en recherche fondamentale pour étudier comment ils se développent et infectent les organismes.

17. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Introduction À quoi servent les cultures de cellules? trois domaines se sont montrés plus intéressants: Systèmes de modèles la production à grande échelle de virus pour une utilisation en production de vaccins. Tests de toxicité Recherche sur le cancer la production à grande échelle de cellules génétiquement modifiées pour produire des protéines présentant une valeur médicale ou commerciale. (les anticorps monoclonaux, l'insuline, les hormones, etc.) Virologie La cellule comme usine de production l'utilisation de cellules en remplacement de tissus et d'organes.

18. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Introduction À quoi servent les cultures de cellules? Systèmes de modèles Tests de toxicité Recherche sur le cancer Virologie La cellule comme usine de production un outil important pour le diagnostic précoce d'affections embryonnaires Conseil génétique

19. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Introduction À quoi servent les cultures de cellules? Systèmes de modèles Tests de toxicité Recherche sur le cancer Virologie La cellule comme usine de production La capacité de reprogrammer les cellules en culture par du nouveau matériel génétique (ADN et gènes) pour étudier les effets cellulaires de l'expression de ces gènes (nouvelles protéines). Conseil génétique Génie génétique

20. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Introduction À quoi servent les cultures de cellules? Systèmes de modèles Tests de toxicité Recherche sur le cancer Virologie La cellule comme usine de production Conseil génétique Génie génétique Les cellules sont cultivées un moment puis réimplantées dans le patient. Thérapie génique

21. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Introduction À quoi servent les cultures de cellules? Systèmes de modèles Tests de toxicité Recherche sur le cancer Virologie La cellule comme usine de production Conseil génétique Génie génétique Thérapie génique Découverte de médicaments

22. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Définition Définition Le cycle cellulaire est l'ensemble des phases par lesquelles une cellule passe entre deux divisions successives.

23. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Généralités • La division cellulaire est le processus fondamental par lequel une cellule-mère donne deux cellules-filles identiques

24. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Généralités Les phases du cycle de division cellulaire la mitose Interphase

25. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Généralités Les phases du cycle de division cellulaire

26. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Généralités Les kinases cycline-dépendantes Entre 1990 et 2000, une douzaine de Cycline / Cdk sont décrites chez l’homme. Six d’entre elles interviennent dans le contrôle direct du déroulement du cycle cellulaire. Les Cdk sont des sérine-thréonine kinases

27. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Généralités Les kinases cycline-dépendantes

28. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Les phases du cycle de division cellulaire Généralités

29. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Les phases du cycle de division cellulaire Généralités Les facteurs mitogènes G1 G1 tyrosine kinases ou encore couplés à des protéines G. S S G2 G2 P P M M cascades P la stimulation de la transcription de gènes essentiels pour l’entrée en division (en particulier cyclines D, CDKs).

30. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Les phases du cycle de division cellulaire Généralités Plusieurs facteurs G1 G1 Les cellules sont maintenues en G1 S S La famille E2F Protéines de la famille du rétinoblastome, pRb, p107 et p130 G2 G2 M M Transcription

31. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Les phases du cycle de division cellulaire Généralités Cycline E/ Cdk 2 Cycline D / Cdk 4 Cycline D / Cdk 6 P G1 G1 Progression G1 P S S La famille E2F Protéines de la famille du rétinoblastome, pRb, p107 et p130 G2 G2 M M Transcription de l’ADN

32. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Les phases du cycle de division cellulaire Généralités La fin de G1 – préparation à la transition G1/S La famille E2F G1 ORC (Origin Recognition Complex ) assemblage d’un complexe préréplicatif (pre-RC) G1 S S G2 G2 accrochage M M recrute cdc6 • cdt1 complexe MCM 2-7 (mini-chromosome maintenance ) facteur de transcription ATPase

33. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Les phases du cycle de division cellulaire Généralités La transition G1/S Plusieurs protéines et complexes protéiques doivent s’associer aux complexes pré-réplicatifs afin que la synthèse d’ADN puisse commencer G1 G1 Activation S S DNA topoisomerases ORC G2 G2 cdc7 MCM10 DNA polymerase M M MCM 2-7 cdc45 Cycline E/ Cdk 2 DNA helicase

34. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Les phases du cycle de division cellulaire Généralités G1 G1 S S S G2 G2 M M

35. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Les phases du cycle de division cellulaire Généralités La phase G2 est souvent présentée comme une phase « de préparation » à la mitose. Elle est marquée par le début de la condensation des chromosomes. G1 La kinase CDK1/cycline A est active en G2, mais ses fonctions demeurent inconnues. Sa participation à l’activation de est une hypothèse. S S S G2 G2 G2 M M

36. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Les phases du cycle de division cellulaire Généralités CDK1/ cycline B (forme active) G1 Condensine S S G2 G2 G2 Survivine Peroxiredoxine M M Lamines Nucleoline

37. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Les phases du cycle de division cellulaire Généralités • La phase M comporte des phases décrites essentiellement sur la base de la morphologie des chromosomes et de l’enveloppe nucléaire, phases décrites il y a plus de cent ans : correspond à la fin de condensation des chromosomes, rupture de l’enveloppe nucléaire 1 la prophase G1 S S est la période de formation du fuseau et du début d’alignement des chromosomes 2 La prométaphase G2 G2 G2 • est la phase d’alignement des chromosomes dans le fuseau, à équidistance des pôles 3 la métaphase M M M 4 l’anaphase voit la disjonction des chromosomes est une période caractérisée par le mouvement des chromosomes vers les pôles, la disparition du fuseau, la décondensation des chromosomes et le début de la cytokinèse. 5 la télophase

38. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Les phases du cycle de division cellulaire Généralités La condensation des chromosomes La condensation des chromosomes est parmi les premiers évènements morphologiques de la division qui aient été décrits La condensine, un complexe constitué de 5 sous unités, est le principal responsable du phénomène de condensation chromosomique. Ses sous-unités sont, chez l’homme, hCAP-C, hCAP-E, hCAP-D2, hCAP-G et hCAP-H. G1 S S La condensine conduit une seule réaction : le super-enroulement, ATP-dépendant, de la molécule d’ADN dans des conditions topologiques définies. G2 G2 M M M Enfin la phosphorylation de l’histone H3 (et de CENP-A) par la kinase Aurora-B est également directement impliquée dans la condensation chromosomique.

39. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Les phases du cycle de division cellulaire Généralités Le fuseau mitotique Les microtubules sont des assemblages non covalents d’hétérodimères de tubuline α et β G1 S S G2 G2 M M M

40. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Les phases du cycle de division cellulaire Généralités La séparation des chromatides et la transition métaphase/anaphase G1 S S G2 G2 M M M

41. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Les phases du cycle de division cellulaire Généralités La cytokinèse La cytokinèse est l’étape finale de la division qui conduit à l’individualisation des deux cellules-filles G1 S S G2 G2 M M M

42. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Les phases du cycle de division cellulaire Généralités Le cycle des centrosomes G1 S S G2 G2 M M M

43. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Méthodes pour étudier le cycle cellulaire Observation directe: cellules en phase M Incorporation de précurseurs radioactifs dans l’ADN biochimiquement (analysant des protéines spécifiques)

44. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Méthodes pour étudier le cycle cellulaire Observation directe: cellules en phase M La durée moyenne est déduite selon le calcul suivant : le temps en culture x [log2]/[log facteur de multiplication du de nombre de cellules] Une observation générale Etudes de cellules vivantes avec le Microscope à contraste de phase. Vidéomicroscopie de time lapse

45. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Méthodes pour étudier le cycle cellulaire Incorporation de précurseurs radioactifs dans l’ADN 1 la thymidinetritiée (3H-thymidine) 2 un marquage de l'ADN par l’ iodure de propidium ou DAPI (À l'aide de la technique de cytometrie de flux ) 3 Incorporation de la bromo-deoxyuridine (BrdU) dans leur ADN.

46. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Méthodes pour étudier le cycle cellulaire Incorporation de précurseurs radioactifs dans l’ADN 1 la thymidinetritiée (3H-thymidine) pour mesurer l'activité de l'ADN polymérase, (une façon indirecte pour mesurer la division cellulaire)

47. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Méthodes pour étudier le cycle cellulaire Incorporation de précurseurs radioactifs dans l’ADN 1 la thymidinetritiée (3H-thymidine) autoradiographies

48. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Méthodes pour étudier le cycle cellulaire Incorporation de précurseurs radioactifs dans l’ADN 2 un marquage de l'ADN par l’ iodure de propidium ou DAPI (À l'aide de la technique de cytometrie de flux ) Pour estimer l’état prolifératif d’une population cellulaire par une estimation du pourcentage de cellules en phase S (estimation du contenu en ADN par cellule.

49. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Méthodes pour étudier le cycle cellulaire Incorporation de précurseurs radioactifs dans l’ADN 3 Incorporation de la bromo-deoxyuridine (BrdU) dans leur ADN. Pour estimer le pourcentage des cellules en phase S de façon plus précise

50. Culture de cellules animales : Le cycle cellulaire et les moyens d'études Méthodes pour étudier le cycle cellulaire biochimiquement (analysant des protéines spécifiques) Détermination de l’activité des protéines kinases cycline-dependantes (Cdk) Les protéines impliquées dans la commande du cycle cellulaire dans les cellules de mammifères ont été identifiées grâce aux études chez la levure (Saccharomyces Cerevisiae et Schizosaccharomyces ).