中華大學生物資訊學系專題報告 定點突變 pUC19 vector 建構 High efficiency TA 克隆之 DNA 複製載體

1. 中華大學生物資訊學系專題報告 定點突變 pUC19 vector建構High efficiency TA克隆之DNA複製載體 SDM pUC19 vector construct High efficiency TA cloning vector 專題組員:吳易庭、林庭聿 指導老師：張慧玫老師 • 摘要 • 使用TA cloning vector是對於PCR聚合酶連鎖反應的反應產物，要清楚讀序的必經步驟。 • TA cloning vector 是利用Taq DNA polymerase(Thermus aquaticus)有對PCR產物會額外在3’端突出多做一個腺嘌呤(A鹼基)的特性，與TA cloning vector 於5’端多一個為胸腺嘧啶(T鹼基)能有效的在連接酶的作用下連接在一起。 • 市面上所販售的TA cloning vector價格昂貴充滿無限的商機。我們研究的目標是自製改版的DNA複製用的載體，是將來到業界低本錢高獲利的技術。 • 簡介 • (一) TA cloning vector介紹 • Taq DNA polymerase會有一個習慣在產物3'端多一個突出的A鹼基，所以如果載體在5'末端带有一個突出的T鹼基，在DNA連接酶的作用下，就可將PCR產物輕鬆直接的克隆到載體上，這種載體稱之為TA cloning vector。這種把PCR產物克隆到載體的方法是目前很普遍的技術，可以大大提高PCR產物的連接效率，連接到載體的PCR產物才能毫無雜訊的清楚讀序。 • (二)pUC19的介紹 • pUC19載體是專供DNA複製保存用載體，帶有篩選標記beta-galactosidase,及抗生素抗藥性(Ampicillin resistance)等可供迅速篩選重組DNA片段。 • 其具有MCS(multi-cloning site)， 可供限制酵素(restriction enzyme)切開，嵌入外來DNA片段，再以接合酶(ligase)接入， MCS 位於Lac Z 基因中，利用IPTG & X-gal 的反應來篩選，藍白篩選篩出具有ligation成功的白色菌落colony。 • (三)目標 • 將實驗室原版載體(pUC19)改版成為TA cloning vector(pUC19 -3型)，以便聚合酶連鎖反應的產物可以直接利用連接酶接入載體裡，一般克隆聚合酶連鎖反應產物兩種方式: • 1.利用限制酶切點和連接酶接入2.利用Taq DNA polymerase聚合酶在產物的3'端加一個A，如果載體5'端,也多一個T以T/A 配對接合。 • 第一種限制酶方式，片段末端，限制酶效率差，較不易成功。第二種T/A方式，只需載體在5'端突出一個T，即可直接使用。此次專題就是在將一般克隆載體製造成TA cloning vector。本研究分五個階段進行，第一階段為去除Amp上的AhdI，第二階段為點突變功能檢測，第三階段為點突變序列檢測，第四階段為裝入AhdI做T/A接點，第五階段為是否接入pUC19-AhdI-WYB檢測 • 實驗流程圖 三.成果 經過本團隊研究後pUC19-3型成功，定序結果(如圖一)經過我們自行比對後(如圖二)確認為pUC19 TA cloning vector，使用藍白篩再次的確認結果(如圖三) 圖一 圖二 圖三