Importância da Investigação da Mutação JAK2V617F no

1. Importância da Investigação da Mutação JAK2V617F no Diagnóstico Diferencial de Neoplasias Mieloproliferativas BCR/ABL negativas e sua Associação com a Expressão da Proteína Antiapoptótica Survivina como Marcador Prognóstico Coordenador(a): Maria Cláudia Santos da Silva Universidade Federal de Santa Catarina Centro de Ciências da Saúde Laboratório de Oncologia Experimental e Hemopatias

2. Coordenador(a):Profa Dra Maria Cláudia Santos da Silva Equipe: Profa. Ms. Joanita Ângela Gonzaga Del Moral (Departamento de Clínica Médica//UFSC) Ana Carolina Rabello de Moraes – Doutoranda PGFAR/UFSC Marley Aparecida Licínio- – Mestranda PGFAR/UFSC Michelle Maccharini Barcelos – Mestranda PGFAR/UFSC. Manoela Lira Reis - Estagiária de Iniciação Científica Pâmela Cristina Gaspar - Estagiária de Iniciação Científica LOEH

3. Introdução: Neoplasias Mieloproliferativas (OMS-2008) • Leucemia Mieloide Crônica (LMC) • Policitemia Vera (PV) • Trombocitemia Essencial (TE) • Mielofibrose Primária (MFP) • Leucemia Neutrofílica Crônica (LNC) • Leucemia Eosinofílica Crônica (LEC) • Síndrome Hipereosinofílica (SHE) • Doença do Mastócito (DM) • Neoplasia Mieloproliferativa sem Classificação LOEH

4. Introdução: Neoplasias Mieloproliferativas (OMS-2008) Leucemia Mielóide Crônica (LMC) NMP crônicas Policitemia Vera (PV) Trombocitemia Essencial (TE) Mielofibrose Primária (MFP) LOEH Barcelos, M. M. (2011).

5. Introdução: Neoplasias Mieloproliferativas (OMS-2008) Leucemia Mielóide Crônica (LMC) NMP crônicas Policitemia Vera (PV) NMPCs BCR/ABL negativas Trombocitemia Essencial (TE) Mielofibrose Primária (MFP) Barcelos, M. M. (2011).

6. Hematopoiese Célula Tronco Multipotente Célula Tronco Mieloide Célula Tronco Linfoide Mieloblasto Proeritroblasto Monoblasto Promielócito Eritroblasto Basófilo Mielócito Basófilo imaturo Eosinófilo imaturo Promonócito Eritroblasto Policromático Metamielócito Eritroblasto Ortocromático Megacariócito Bastonete Reticulócito Basófilos LOEH Fonte: http://www.irvingcrowley.com/cls/maturation.htm Eosinófilos Neutrófilos Monócitos Plaquetas Eritrócitos Linfócitos T e B

7. NeoplasiasMieloproliferativas Célula Tronco Multipotente Célula Tronco Mieloide Célula Tronco Linfoide Mieloblasto Proeritroblasto Monoblasto Promielócito Eritroblasto Basófilo Mielócito Basófilo imaturo Eosinófilo imaturo Promonócito Eritroblasto Policromático LllLeucemiamielóidecrônica Mielofibroseprimária Leucemiamielomonocítica Trombocitemiaessencial Policitemiavera Metamielócito Eritroblasto Ortocromático Megacariócito Bastonete Reticulócito Basófilos LOEH Fonte: http://www.irvingcrowley.com/cls/maturation.htm Eosinófilos Neutrófilos Monócitos Plaquetas Eritrócitos Linfócitos T e B

8. Neoplasias Mieloproliferativas BCR/ABL Negativas Constituem um grupo heterogêneo de doenças hematopoiéticas clonais Expansão clonal Acúmulo de células maduras em sangue periférico Elevado risco de eventos trombóticos Risco de desenvolvimento de LMA e SMD LOEH MORAES, A.C.R.

9. Neoplasias Mieloproliferativas BCR/ABL Negativas Difícil devido à sobreposição de sinais e sintomas com outras doenças não oncológicas Hemograma Biópsia de medula óssea Sintomas LOEH

10. Neoplasias Mieloproliferativas BCR/ABL Negativas Mutação pontual: substituição de uma guanina por timina JAK2V617F GOLDMAN, 2005 (N Engl J Med) • Policitemia Vera: 90% • Trombocitemia Essencial: 50% • Mielofibrose Primária: 50% LOEH Barcelos, M. M. (2011).

11. Objetivo Avaliar a importância da investigação da mutação JAK2V617F no diagnóstico diferencial de neoplasias mieloproliferativas BCR/ABL negativas (Policitemia Vera, Trombocitemia Essencial e Mielofibrose Primária) e sua associação com a expressão da proteína antiapoptóticasurvivina como marcador prognóstico. LOEH

12. Objetivos específicos • Investigar a presença da translocação t(9;22) nas amostras de sangue total e/ou na medula óssea dos pacientes em investigação de neoplasias mieloproliferativas, por RT-PCR, para exclusão dos casos BCR/ABL positivas (LMC); • Detectar a mutação JAK2V617F nas amostras de sangue total dos pacientes em investigação de neoplasias mieloproliferativas BCR/ABL negativos, por PCR alelo específico; • Analisar a expressão da proteína antiapoptótica survivina nas biópsias de medula óssea dos pacientes BCR/ABL negativos por imunohistoquímica; LOEH

13. Objetivos específicos • Associar a expressão da mutação JAK2V617F com o subtipo de NMP observado na avaliação clínica, resposta ao tratamento e evolução da doença; • Avaliar a importância da detecção da mutação JAK2V617F e sua associação com a proteína antiapoptótica survivina no diagnóstico diferencial, no prognóstico e no monitoramento terapêutico dos pacientes com NMP. LOEH

14. Metodologia : Aspectos éticos • O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa da Universidade Federal de Santa Catarina - UFSC (Protocolo de pesquisa no 150/09) e do Centro de Pesquisas Oncológicas - CEPON (Protocolo de pesquisa no 016/2010). • Participaram do estudo somente os pacientes que concordaram em participar do mesmo e assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. LOEH

15. Metodologia: População do Estudo • No período de Janeiro 2010 a Dezembro de 2011 foram avaliadas as amostras de sangue periférico e/ou medula óssea de todos os pacientes com suspeita clínica de neoplasias mieloproliferativas NMP referenciados ao Hospital Universitário da UFSC (referência para neoplasias hematológicas/SUS/SC), num total de 305 amostras. • Após a coleta, as amostras foram encaminhadas ao Laboratório de Oncologia Experimental e Hemopatias para análise no máximo até duas horas após a coleta, onde foram realizados os seguintes procedimentos laboratoriais. LOEH

16. Metodologia Pesquisadatranslocação(9;22) Transcrição reversa - Reação em Cadeia da Polimerase (RT-PCR) LOEH

17. Pesquisadatranslocação(9;22) Metodologia: van DONGEN et al., 1999 LOEH

18. Pesquisadatranslocação(9;22) Metodologia: A Transcrito b3-a2 (frequência 55%) B BCR Éxon14 Éxon2 Éxon 3 Éxon 4 ABL > C van DONGEN et al., 1999 E3’ 521pb LOEH MORAES, A.C.R. 445pb

19. Pesquisadatranslocação(9;22) Metodologia: LOEH

20. Metodologia PesquisadaMutação JAK2V617F Reação em Cadeia da Polimerase alelo específico (PCR alelo específico) LOEH

21. PesquisadaMutação JAK2V617F: PCR alelo específico Utilização de 3 primers: F1 (alelo normal) 5’ - ATC TAT AGT CAT GCT GAA AGT AGG AGA AAG – 3’ F2 (alelomutante) 5’ - AGC ATT TGG TTT TAA ATT ATG GAG TAT ATT – 3’ R1 5’ - CTG AAT AGT CCT ACA GTG TTT TCA GTT TCA – 3’ CAMPBELL et al., (Methods in Molecular Medicine) LOEH

22. Métodos Alelo JAK2 do tipo “selvagem” F1 G R1 364pb Alelo JAK2 V617F F2 F1 T R1 364pb F1 203pb F2 MORAES, A.C.R. CAMPBELL et al., (Methods in Molecular Medicine) R1

23. PesquisadaMutação JAK2V617F: PCR alelo específico LOEH BARCELOS, 2011

24. Metodologia Expressão da proteína antiapoptóticasurvivina Reação de Imunohistoquímica LOEH

25. ExpressãodaProteínaSurvivina: Imunohistoquímica DAB + H2O2 Streptoavidida conjugada DAB + H2O + O. P Ac secundário biotinilado Ac primário Epítopo da proteína

26. Análise da expressão da proteína antiapoptótica survivina nas biópsias de medula óssea. Positivo Negativo LOEH

27. Metodologia Análise dos prontuários • Hematócrito • Concentração de hemoglobina • Trombose • Esplenomegalia • Idade • Sexo • Contagem de eritrócitos • Contagem de leucócitos • Contagem de plaquetas LOEH

28. Metodologia: Avaliação estatística A análise estatística foi realizada utilizando-se o teste “t” de Student não pareado. Os valores de P<0,05 foram considerados estatisticamente significantes. LOEH

29. Resultados e Discussão: Detecção da mutação JAK2V617F Foram encaminhadas ao LOEH, 305 amostras com suspeita de NMPC (jan/2010 a dez/2011) 64 pacientes obtiveram o diagnóstico de PV, TE ou MFP LOEH 25 casos (39%) foram negativos para a mutação JAK2V617F 39 casos (61%) foram positivos para a mutação JAK2V617F

30. Resultados e Discussão: Distribuição dos casos com diagnóstico de NMPC BCR/ABL negativa que foram submetidos à investigação da mutação JAK2V617F, de acordo com a idade LOEH A mutação JAK2V617F mostrou-se mais frequente em indivíduos mais idosos

31. Resultados e Discussão: Frequência de esplenomegalia nos pacientes com diagnóstico de NMPC BCR/ABL negativa distribuídos de acordo com a presença ou ausência da mutação JAK2V617F. LOEH Não houve associação entre a presença da mutação JAK2V617F e a ocorrência de esplenomegalia

32. Resultados e Discussão: Frequência de trombose nos pacientes com diagnóstico de NMPC BCR/ABL negativa distribuídos de acordo com a presença ou ausência da mutação JAK2V617F LOEH Não houve associação entre a presença da mutação JAK2V617F e a ocorrência de trombose.

33. Resultados e Discussão: Frequência dos subtipos de NMPCs BCR/ABL negativas de acordo com a presença ou ausência da mutação JAK2V617F LOEH Esses resultados podem fornecer informações sobre a prevalência de cada subtipo de NMPC BCR/ABL negativa na região da Grande Florianópolis

34. Resultados e Discussão: Frequência dos subtipos de NMPCs BCR/ABL negativas de acordo com a presença ou ausência da mutação JAK2V617F Variações na frequência da mutação JAK2V617F: MFP: 35% a 57% PV: 65% a 97% TE: 23% a 57% LOEH

35. Resultados e Discussão: A mutação JAK2V617F não está associada à ocorrência de anormalidades laboratoriais nos indivíduos com MFP

36. LOEH

37. Esses resultados sugerem que há associação da mutação com a expansão da linhagem mielóide

38. Conclusões: • A mutação JAK2V617F apresentou alta prevalência (61%) nos pacientes com NMPC BCR/ABL negativa referenciados ao Hospital Universitário da UFSC. • O subtipo de NMPC BCR/ABL negativa de maior prevalência nos pacientes referenciados ao Hospital Universitário da UFSC foi a TE (61%). LOEH

39. Conclusões: • Houve uma associação estatisticamente significativa entre a presença da mutação JAK2V617F e os indivíduos mais idosos, o que a caracteriza como adquirida. • Não houve associação entre a presença da mutação JAK2V617F e eventos trombóticos de modo geral. • Não houve associação entre a presença da mutação e a ocorrência de esplenomegalia. LOEH

40. Conclusões: • A presença da mutação JAK2V617F nem sempre está associada com a ocorrência de anormalidades laboratoriais (contagem de hemácias, leucócitos e plaquetas, concentração de hemoglobina e índice de hematócrito) nos indivíduos com NMPC BCR/ABL negativa. • A expressão da proteína survivina não foi detectada nas biópsias de medulas ósseas dos indivíduos deste estudo, portanto, a investigação da expressão da proteína survivina não serve como um bom marcador para o diagnóstico dos pacientes com NMPC BCR/ABL negativa.

41. Impactos do Projeto – Científico • Implementação desta metodologia moderna de diagnóstico, que não é realizada pelos laboratórios que atendem SUS, foi importante para o diagnóstico e prognóstico de neoplasias mieloproliferativas. Além disso, permitiu o desenvolvimento de projetos com tecnologia avançada e com resultados de impacto. • Consolidação de um grupo de pesquisa multiprofissional, o qual vem buscando integração entre a pesquisa, o ensino e assistência, e, é pioneiro no Estado de Santa Catarina na área de diagnóstico laboratorial hematológico e pela junção das linhas de investigação clínica e laboratorial. • Formação de recursos humanos: estudantes de graduação (iniciação científica) e pós-graduação qualificados. Uma dissertação de mestrado foi concluída em Fevereiro de 2011 e um estágio de iniciação científica finalizado em 2010.

42. Produção Científica (Artigos em periódico indexado) • BARCELOS, MM; SANTOS-SILVA, MC. Molecular approach on diagnosis of BCR/ABL negative chronic myeloproliferative neoplasms. Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia, V 33 pg 296, 2011. • BARCELOS, M. M. ; MORAES, A. C. R.; REIS, M. L.; I-CHING, L.; MORAL, J.A.G.D.; SILVA, R.M.; BAZZO, M.L.; SANTOS-SILVA, M. C. Association between JAK2V617F mutation and clinical and laboratorial findings in patients with BCR-ABL-negative chronic myeloproliferative neoplasms. Submetido na Revista Annal of Clinical Biohemistry . LOEH

43. Produção Científica: Dissertação de Mestrado • BARCELOS, M. M. Importância da Investigação da Mutação JAK2V617F em Pacientes com Neoplasia Mieloproliferativa Crônica BCR/ABL negativa e sua Associação com a Expressão da Proteína Antiapoptótica Survivina como Marcador Diagnóstico.2011. 138 p. Dissertação (Mestrado em Farmácia)- Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis LOEH

44. Produção Científica: Resumos publicados em Anais de Congresso • BARCELOS, MM; MORAES, ACR; LIRA-REIS, M; DEL MORAL, JAG; I-CHING, L; BAZZO, ML; SANTOS-SILVA, MC. Diagnóstico de Neoplasias Mieloproliferativas clássicas BCR/ABL negativas segundo os critérios da OMS-2008. In: Congresso Brasileiro de Hematologia e Hemoterapia, 2010, Brasília. Resumo publicado na Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia, 2010. v. 32. p. 140. • BARCELOS, M. M. ; REIS, M. L. ; MORAES, A. C. R.; MORAL, J.A. Gonzaga D.; I-Ching, Lee ; BAZZO, M.L.; SANTOS-SILVA, M. C. Importância da Investigação da Mutação JAK2V617F em Pacientes com Neoplasia Mieloproliferativa Crônica BCR/ABL negativa In: Congresso Brasileiro de Hematologia e Hemoterapia, 2011, São Paulo. Resumo publicado na Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia, 2011. v. 33. p. 141. LOEH

45. Impactos do Projeto – Econômico/Social LOEH • Indubitavelmente, após a implementação dessa metodologia diagnóstica na rotina dos laboratórios clínicos de referência em hemopatias malignas, que fazem atendimento pelo SUS, como o HU-UFSC, teremos uma melhoria da qualidade de vida dos pacientes atendidos. • O Laboratório de Oncologia Experimental e Hemopatias da UFSC é o único laboratório público de Santa Catarina que realiza estes exames para os pacientes do SUS. Atendemos solicitações de várias cidades do Estado. Sendo assim, acreditamos que estamos contribuindo com o desenvolvimento regional na área de diagnóstico laboratorial.

46. Aplicabilidade para o SUS • Com a implementação dessa metodologia para o diagnóstico diferencial de neoplasias mieloproliferativas na rotina dos laboratórios clínicos de referência em hemopatias malignas, que fazem atendimento pelo SUS, certamente teremos um diagnóstico laboratorial mais ágil e eficiente, o que implica na redução do tempo para o diagnóstico clínico e na decisão do tratamento mais adequado. Isso diminui os custos do SUS e aumenta a cobertura de serviços. LOEH

47. HCPr: 11 Blumenau: 20 Rio do Sul: 1 Videira: 1 HU: 202 CEPON: 62 HEMOSC: 36 HGCR: 02 HRSJ: 19 Criciúma: 48 LOEH http://www.guianet.com.br/sc/mapasc.htm

48. A descoberta da mutação JAK2V617F foi fundamental para estabelecer ideias cruciais ao entendimento da base genética das NMPCs, porém muitas questões ainda permanecem sem resposta. Apesar de trabalhos na literatura fornecerem uma ideia de como uma única mutação pode resultar em três fenótipos diferentes, estudos ainda são necessários para determinar marcadores moleculares específicos para cada subtipo de NMPC. Considerações Finais • Apesar da metodologia já ter sido implementada num laboratório de pesquisa, o SUS precisa criar um código de pagamento para os laboratórios clínicos públicos que executem esta análise possam dar continuidade as atividades iniciadas com esse projeto. • Com a continuidade do projeto teremos as informações epidemiológicas da frequência dos subtipos de NMPc no Estado de Santa Catarina. Esses dados são importantes para o planejamento de custos com essas doenças. LOEH

49. OBRIGADA ! LOEH