Interattori molecolari nel controllo della tolleranza immune

1. Interattori molecolari nel controllo della tolleranza immune Dott. Fortunato Ferrara Tutore e Relatore: Dott. Alberto Tommasini

2. CD4+ CD25+ Cellule T regolatorie L’omeostasi del sistema immunitario Protezione dai microrganismi Tolleranza verso il SELF

3. Tolleranza centrale: • Selezione positiva • - Corteccia timica. • Timociti immaturi. • Riconoscimento della molecola MHC esposta dalle cellule dell’epitelio timico. • Il non riconoscimento porta alla delezione. • Selezione negativa • Zona interna (midollare) del timo. • È controllata da cellule presentanti l’antigene (APC). • Timociti con alta affinità per gli antigeni self presentati dalle APC vengono eliminati. Tolleranza periferica - Svolta principalmente dalle cellule T regolatorie. - Controllano e sopprimono la reattività contro il self di linfociti T “sfuggiti” alla selezione timica.

4. Ruolo delle CD4+ Treg nelle situazioni di “normalità”o patologiche Cellule Teff autoreattive “sfuggite” alla selezione timica Cellule Teff contro i non-self CD4+CD25+ Treg - Foreign Patogeni Tumori Trapianti Self Teff Protezione dallo sviluppo di patologie autoimmuni Controllo dei processi immunitari

5. Dalla clinica alla ricerca di base Il caso di Lorenzo… -Risposta solo parziale a nutrizione parenterale totale (non allergia!) -Nei mesi successivi si verificano diversi episodi di polmonite interstiziale, di eziologia incerta, accompagnati da peggioramenti dell'eczema e della diarrea, -Biopsia intestinale: enteropatia autoimmune. -Nel 2° anno anemia emolitica, alopecia e DMT1

6. IPEX Disregolazione immunologica Poliendocrinopatia Enteropatia Trasmissione X-linked recessiva Mancato funzionamento cellule Treg • Presente nei primi anni di vita: • IDDM • Severa enteropatia • Disordine epidermici • Fenomeni autoimmuni • vari Autoanticorpi contro: Tiroide Rene Isole pancreatiche Intestino tenue Piastrine ed altro

7. FoxP3 nelle cellule Treg • Foxp3 è un fattore trascrizionale – FKH family – specifico per le cellule Treg • E’ il master regulatorper lo sviluppo e la funzione delle cellule€ Treg • Le mutazioni del gene Foxp3 portano alla comparsa dell’IPEX Ο = missense point mutations = deletion/frameshift mutations  = splicing mutations Come fattore trascrizionale: • Regolatore/soppressore della produzione di citochine NFAT e NF-kappaB Blocca/regola la capacità di esprimere proteine chiave per la produzione di citochine ed altri fattori essenziali all’attivazione

8. Il ruolo “a valle” di FOXP3 Induzione alla trascrizione di alcuni geni Soppressione della trascrizione di altri geni

10. …“a monte” di FOXP3 Identificazione delle proteine che interagiscono con FOXP3, permettendo la localizzazione e funzione ? Patologie – IPEX like Foxp3 NFAT

11. Interessante analizzare la cascata di eventi molecolari che portano alla attivazione di FOXP3 Analisi degli interattori

12. Obbiettivi: 1- Produzione di Foxp3 come proteina ricombinante 2- Valutazione di diverse metodiche biomolecolari per isolamento di potenziali nuovi interattori

13. 1 - Produzione di Foxp3 in forma ricombinante FOXP3 + Mal Circa 90KDa mRNA cDNA Foxp3 PCR amplification Zn-fing N-term PBL cells FKH Produzione Riconoscimento proteina con Ab-specifico Purificazione

14. Amilosio MW 90 Kda MBP Foxp3 85 Kda 75 KDa 45 KDa Amilosio MW 45 Kda MBP 25 Kda 15 KDa 2.1 - Co-precipitazione MBP Foxp3 MBP

15. 2.2 Immuno-precipitazione MBP MBP Foxp3 Foxp3 Y Y Proteina G Y Y Y Y

16. scFv Gene III Phagemid vector Ori Phage display antibody libraries Lymphocytes scFv Helper phage gene III CH1 CH2 CH3 VH VL CL mRNA E. coli cDNA linker PCR Transformation assembly PCR scFv cloning Amp

17. VH VH VH VL VL VL ELISA Foxp3 CH2 WB CH3 SV5 Minibody

18. Immunoprecipitazione MBP MBP Foxp3 Foxp3 Y Y Y Y Y Y Verifica della metodica Per interattori noti (NFAT/NfkB)

19. displaydi peptidi casuali 2.3 Costruzione di libreria di cDNA di cellule Treg scFv Gene III Vettore pPAO fagmidico Ori cDNA frammentazione Cellule o tessuti Amp

20. Isolamento cloni più reattivi sequenziamento FP3 Analisi sequenze: - 25 cloni selezionati - 24 riconfermano uno stesso peptide - 1 peptide diverso

21. PRR Zn FKH FOXP3 Analisi dell’interazione con i domini FKH Zn PRR • Il clone di “tipo 1” è specifico per l’interazione con il dominio Zinc-finger • Il clone di “tipo 2” riconosce la proteina intera ma non uno dei singoli domini: • eventuale effetto di mancata conformazione dei domini ricombinanti

22. La maggioranza dei cloni (24/25) codificano per una peptide di 100a.a. BLAST: Sequences producing significant alignments: Score E value solute carrier family 25, member 23 [Homo sapiens] 176 4e-43 putative calcium binding transporter [Homo sapiens] 175 7e-43 INTER PRO SCAN Q96NQ4_HUMAN_Q96NQ4 Efhand No description EF_HAND_2 EF_HAND_1 No description Calmodulin Calcineurin signaling proteins These proteins typically undergo a calcium - dependent conformational change which opens a target binding site.

23. Il restante clone: BLAST: Sequences producing significant alignments: Score E value matrix metalloproteinase-3 224 2e-57 INTER PRO SCAN MATRIXIN Peptidase_M10 No description No description MATRIX METALLOPROTEINASE STROMELYSIN They are zinc- dependent, calcium-activated proteases

24. AP Y Y FP3 interattore Clone selezionato (dominio EFH) prodotto in forma ricombinante

25. Analisi di omologia clone isolato con dominio EFH della calcineurina B a – calcineurina B b – NFAT c – Foxp3

26. AP Y Y FP3 AP Y interattore Y FP3 AP Calc B Y Y FP3 EFH calcB

27. Risultati • Validato il sistema delle librerie anticorpali fagiche per la selezione e produzione di efficaci anticorpi ricombinanti contro Foxp3. • Messa a punto di un protocollo di immunoprecipitazione per successive conferme di ulteriori interattori molecolari di Foxp3. • Capacità di isolare mediante librerie peptidiche fagiche potenziali nuovi domini proteici interagenti con Foxp3. • Verificata l’interazione tra Foxp3 ed una struttura calcio legante (EFH). C’è la possibilità che i peptidi selezionati non identificano reali proteine coinvolte nel network di attivazione di FOXP3, ma solo “motivi strutturali” coinvolti.

28. …sviluppi futuri e futuribili • Confermare la potenziale interazione caratterizzata in una proteina “fisiologicamente • significativa”. • -Utilizzare gli anticorpi ricombinanti prodotti e caratterizzati in altri saggi sperimentali, • anche con possibile sviluppo clinico-prognostico (immunoistochimica su tessuti tumorali o sedi di infiammazioni croniche). • -Messa a punto di una librerie peptidica fagica maggiormente specifica per descrivere • il complesso proteico caratteristico delle cellule Treg.