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Técnicas de Imunologia

Técnicas de Imunologia. Citometria de Fluxo. Slides adaptados de uma colecção amavelmente cedida por Alexandre Salvador (BioAtlântico). O que é um Citometro de Fluxo?. O que é um Citómetro de Fluxo?. É um aparelho que permite analisar vários parâmetros (celulares?)

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Presentation Transcript

  1. Técnicas de Imunologia Citometria de Fluxo Slides adaptados de uma colecção amavelmente cedida por Alexandre Salvador (BioAtlântico) Prof.Doutor José Cabeda

  2. O que é um Citometro de Fluxo? Prof. Doutor José Cabeda

  3. O que é um Citómetro de Fluxo? • É um aparelho que permite analisar vários parâmetros (celulares?) • Capta e digitaliza a dispersão de fotões, provocada pela passagem de partículas em suspensão alinhadas uma a uma, num fluxo laminar, frente a um feixe de luz. Prof. Doutor José Cabeda

  4. Componentes Básicos de um Citómetro de Fluxo • Suspensão de partículas • Fluxo laminar Fluídos Óptica • Fonte de iluminação • Captação da dispersão da luz e da fluorescência • Filtração da dispersão e da fluorescência Electrónica • Conversão do sinal em valores analógico-digitais • Aquisição, Processamento, Análise e Armazenamento por computador Prof. Doutor José Cabeda

  5. Prof. Doutor José Cabeda

  6. Exemplos do que podemos analisar por Citometria de Fluxo: Complexidade Antigénios celulares Tamanho Metabolismos Enzimas Receptores ADN Citoquinas Prof. Doutor José Cabeda

  7. Laser Propriedades de FSC e SSC Prof. Doutor José Cabeda

  8. Laser Sensor de FS Óptica - Canal de Dispersão Frontal ( tamanho- FS ) Prof. Doutor José Cabeda

  9. Laser Sensor de FS Sensor SS 900 Óptica - Canal de Dispersão Lateral ( complexidade- SS ) Prof. Doutor José Cabeda

  10. Laser Sensor de FS Detectores de Fluorescência (PMT1, PMT4 etc.) Óptica - Dispersão da Fluorescência Prof. Doutor José Cabeda

  11. Óptica - Propriedade dos Filtros Filtro ou Espelho Dicróico Colocado a 45o Fonte de Luz Luz Transmitida Luz Reflectida Prof. Doutor José Cabeda

  12. BD Prof. Doutor José Cabeda

  13. Prof. Doutor José Cabeda

  14. O que pode então dizer um Citometro de fluxo de uma célula? • Tamanho (FSC) • Complexidade (SSC) • Fluorescência relativa.(FL1, FL2, FL3, FL4,...) Prof. Doutor José Cabeda

  15. Prof. Doutor José Cabeda

  16. Laser O que é a Fluorescência? Prof. Doutor José Cabeda

  17. Emitted Fluorescence IntensityBinding Sites FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC Numero de eventos Intensidade de Fluorescência Intensidade de Fluorescência Prof. Doutor José Cabeda

  18. Fluorochrome Laser (nm) Emission (nm) FITC 488 525 Cy3 488 565 R-PE (PE) 488 575 PE-Texas Red (PE-TR)488615 Pe-Cy5 (TC1) 488 667 PerCP (BD2) 488 675 PerCP/Cy5.5 (BD) 488 695 PE-Cy7 488 767 Texas Red 595 615 APC 633, 635 660 Cy5 633, 635 667 APC-Cy7 633, 635 767 Currently Available Fluorochromes (Visible Light Emission) Prof. Doutor José Cabeda

  19. FITC PI RPE APC PerCP 1000 800 600 400 200 0 400 450 500 550 600 650 700 Wavelength (nm) Espectros de Emissão Prof. Doutor José Cabeda

  20. Laser Voltage Time Laser Voltage Time Voltage Laser Time Pulso electrónico Prof. Doutor José Cabeda

  21. 1 parâmetro Histograma 2 parâmetros Dot Plot Contour plot Density plot Tipos de diagramas Prof. Doutor José Cabeda

  22. As Regiões ou Portas electrónicas Histograma Dot plot Prof. Doutor José Cabeda

  23. ES GS Molécula Donadora PE Molécula Receptora Texas Red/Cy5/Cy7 TRANSFERENCIA DE ENERGIA POR RESSONÂNCIA Transferencia no radiativa de energía Fluorescencia Energía Prof. Doutor José Cabeda

  24. 1 LASER (488nm) 3 COLORES Prof. Doutor José Cabeda

  25. 1 LASER (488nm) 4 COLORES Prof. Doutor José Cabeda

  26. 1 LASER (488nm) 5 COLORES Prof. Doutor José Cabeda

  27. Cytomics™ FC500 Prof. Doutor José Cabeda

  28. 2 lasers colineares: 488 nm 633 nm Detectores: FS con dos ángulos de captura (1-8°, 1-19°) Side Scatter 5 PMT sensibles al rojo (de 185 a 900 nm) Cytomics™ FC500OPTICA: Prof. Doutor José Cabeda

  29. Side Scatter FL3 600DLP 620DSP 620SP 500LP FL4 FL1 525BP 675BP 550DLP 710DLP 755LP 488DLP FL2 FL5 Detailed Filter Specs Cytomics™ FC500OPTICA: Prof. Doutor José Cabeda

  30. COMPENSATION Prof. Doutor José Cabeda

  31. FITC PE ECD PC5 Intensity Wavelength nm 500 600 700 800 Prof. Doutor José Cabeda

  32. 500 600 700 800 FITC PE ECD PC5 Intensity FL1525 Prof. Doutor José Cabeda

  33. 500 600 700 800 FITC PE ECD PC5 Intensity FL1525 FL2575 Prof. Doutor José Cabeda

  34. 500 600 700 800 FITC PE ECD PC5 Intensity FL1525 FL2575 FL3620 Prof. Doutor José Cabeda

  35. 500 600 700 800 FITC PE ECD PC5 Intensity FL1525 FL2575 FL3620 FL4675 Prof. Doutor José Cabeda

  36. 500 600 700 FL1 FL2 FL3 FL4 100 12 1 <0.1 FITC Nominal Measured Signal Prof. Doutor José Cabeda

  37. FITC+ PE+ ECD+ PC5+ FITC PE ECD PC5 FL1 FL2 FL3 FL4 Prof. Doutor José Cabeda

  38. FITC PE ECD PC5 FL1 ???? FL2 ???? FL3 ???? FL4 ???? Prof. Doutor José Cabeda

  39. FITC PE ECD PC5 FL1 85.5% 0.7% 0.3% 0.2% FL2 10.5% 67.8% 8.4% 4.2% FL3 3.1% 25.0% 66.7% 2.3% FL4 0.9% 6.5% 24.6% 93.3% Prof. Doutor José Cabeda

  40. FITC PE ECD PC5 FL1 100% 1.1% 0.4% 0.2% FL2 12.3% 100% 12.7% 4.5% FL3 3.6% 36.8% 100% 2.4% FL4 1.0% 9.5% 36.9% 100% Prof. Doutor José Cabeda

  41. Uncompensated vs Compensated FL2 FL1 Prof. Doutor José Cabeda

  42. COMPENSATION IS INTENSITY DEPENDENT FL2 FL1 fully compensated uncompensated partially compensated Prof. Doutor José Cabeda

  43. COMPENSATE INSTRUMENT USING STAINED CELLS 1. Adjust PMT voltages using unstained cells 2. Adjust compensation for each fluorochrome Prof. Doutor José Cabeda

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