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Técnicas de Imunologia. Citometria de Fluxo. Slides adaptados de uma colecção amavelmente cedida por Alexandre Salvador (BioAtlântico). O que é um Citometro de Fluxo?. O que é um Citómetro de Fluxo?. É um aparelho que permite analisar vários parâmetros (celulares?)

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Presentation Transcript
t cnicas de imunologia

Técnicas de Imunologia

Citometria de Fluxo

Slides adaptados de uma colecção

amavelmente cedida por

Alexandre Salvador (BioAtlântico)

Prof.Doutor José Cabeda

o que um citometro de fluxo
O que é um Citometro de Fluxo?

Prof. Doutor José Cabeda

o que um cit metro de fluxo
O que é um Citómetro de Fluxo?
  • É um aparelho que permite analisar vários parâmetros (celulares?)
  • Capta e digitaliza a dispersão de fotões, provocada pela passagem de partículas em suspensão alinhadas uma a uma, num fluxo laminar, frente a um feixe de luz.

Prof. Doutor José Cabeda

componentes b sicos de um cit metro de fluxo
Componentes Básicos de um Citómetro de Fluxo
  • Suspensão de partículas
  • Fluxo laminar

Fluídos

Óptica

  • Fonte de iluminação
  • Captação da dispersão da luz e da fluorescência
  • Filtração da dispersão e da fluorescência

Electrónica

  • Conversão do sinal em valores analógico-digitais
  • Aquisição, Processamento, Análise e Armazenamento por computador

Prof. Doutor José Cabeda

exemplos do que podemos analisar por citometria de fluxo
Exemplos do que podemos analisar por Citometria de Fluxo:

Complexidade

Antigénios celulares

Tamanho

Metabolismos

Enzimas

Receptores

ADN

Citoquinas

Prof. Doutor José Cabeda

propriedades de fsc e ssc

Laser

Propriedades de FSC e SSC

Prof. Doutor José Cabeda

ptica canal de dispers o lateral complexidade ss

Laser

Sensor de FS

Sensor SS 900

Óptica - Canal de Dispersão Lateral ( complexidade- SS )

Prof. Doutor José Cabeda

ptica dispers o da fluoresc ncia

Laser

Sensor de FS

Detectores de Fluorescência

(PMT1, PMT4 etc.)

Óptica - Dispersão da Fluorescência

Prof. Doutor José Cabeda

ptica propriedade dos filtros
Óptica - Propriedade dos Filtros

Filtro ou Espelho Dicróico Colocado a 45o

Fonte de Luz

Luz Transmitida

Luz Reflectida

Prof. Doutor José Cabeda

slide12

BD

Prof. Doutor José Cabeda

o que pode ent o dizer um citometro de fluxo de uma c lula
O que pode então dizer um Citometro de fluxo de uma célula?
  • Tamanho (FSC)
  • Complexidade (SSC)
  • Fluorescência relativa.(FL1, FL2, FL3, FL4,...)

Prof. Doutor José Cabeda

o que a fluoresc ncia

Laser

O que é a Fluorescência?

Prof. Doutor José Cabeda

intensidade de fluoresc ncia

Emitted Fluorescence IntensityBinding Sites

FITC

FITC

FITC

FITC

FITC

FITC

FITC

FITC

FITC

FITC

Numero de eventos

Intensidade de Fluorescência

Intensidade de Fluorescência

Prof. Doutor José Cabeda

currently available fluorochromes visible light emission

Fluorochrome Laser (nm) Emission (nm)

FITC 488 525

Cy3 488 565

R-PE (PE) 488 575

PE-Texas Red (PE-TR)488615

Pe-Cy5 (TC1) 488 667

PerCP (BD2) 488 675

PerCP/Cy5.5 (BD) 488 695

PE-Cy7 488 767

Texas Red 595 615

APC 633, 635 660

Cy5 633, 635 667

APC-Cy7 633, 635 767

Currently Available Fluorochromes (Visible Light Emission)

Prof. Doutor José Cabeda

espectros de emiss o

FITC

PI

RPE

APC

PerCP

1000

800

600

400

200

0

400

450

500

550

600

650

700

Wavelength (nm)

Espectros de Emissão

Prof. Doutor José Cabeda

pulso electr nico

Laser

Voltage

Time

Laser

Voltage

Time

Voltage

Laser

Time

Pulso electrónico

Prof. Doutor José Cabeda

tipos de diagramas
1 parâmetro

Histograma

2 parâmetros

Dot Plot

Contour plot

Density plot

Tipos de diagramas

Prof. Doutor José Cabeda

as regi es ou portas electr nicas
As Regiões ou Portas electrónicas

Histograma

Dot plot

Prof. Doutor José Cabeda

transferencia de energia por resson ncia

ES

GS

Molécula Donadora

PE

Molécula Receptora

Texas Red/Cy5/Cy7

TRANSFERENCIA DE ENERGIA POR RESSONÂNCIA

Transferencia no radiativa de energía

Fluorescencia

Energía

Prof. Doutor José Cabeda

1 laser 488nm 3 colores
1 LASER (488nm) 3 COLORES

Prof. Doutor José Cabeda

1 laser 488nm 4 colores
1 LASER (488nm) 4 COLORES

Prof. Doutor José Cabeda

1 laser 488nm 5 colores
1 LASER (488nm) 5 COLORES

Prof. Doutor José Cabeda

cytomics fc500
Cytomics™ FC500

Prof. Doutor José Cabeda

cytomics fc500 optica
2 lasers colineares:

488 nm

633 nm

Detectores:

FS con dos ángulos de captura (1-8°, 1-19°)

Side Scatter

5 PMT sensibles al rojo (de 185 a 900 nm)

Cytomics™ FC500OPTICA:

Prof. Doutor José Cabeda

cytomics fc500 optica29

Side Scatter

FL3

600DLP

620DSP

620SP

500LP

FL4

FL1

525BP

675BP

550DLP

710DLP

755LP

488DLP

FL2

FL5

Detailed Filter Specs

Cytomics™ FC500OPTICA:

Prof. Doutor José Cabeda

compensation
COMPENSATION

Prof. Doutor José Cabeda

slide31

FITC

PE

ECD

PC5

Intensity

Wavelength nm

500

600

700

800

Prof. Doutor José Cabeda

slide32

500

600

700

800

FITC

PE

ECD

PC5

Intensity

FL1525

Prof. Doutor José Cabeda

slide33

500

600

700

800

FITC

PE

ECD

PC5

Intensity

FL1525

FL2575

Prof. Doutor José Cabeda

slide34

500

600

700

800

FITC

PE

ECD

PC5

Intensity

FL1525

FL2575

FL3620

Prof. Doutor José Cabeda

slide35

500

600

700

800

FITC

PE

ECD

PC5

Intensity

FL1525

FL2575

FL3620

FL4675

Prof. Doutor José Cabeda

slide36

500

600

700

FL1

FL2

FL3

FL4

100

12

1

<0.1

FITC

Nominal Measured Signal

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slide37

FITC+

PE+

ECD+

PC5+

FITC

PE

ECD

PC5

FL1

FL2

FL3

FL4

Prof. Doutor José Cabeda

slide38

FITC

PE

ECD

PC5

FL1

????

FL2

????

FL3

????

FL4

????

Prof. Doutor José Cabeda

slide39

FITC

PE

ECD

PC5

FL1

85.5%

0.7%

0.3%

0.2%

FL2

10.5%

67.8%

8.4%

4.2%

FL3

3.1%

25.0%

66.7%

2.3%

FL4

0.9%

6.5%

24.6%

93.3%

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slide40

FITC

PE

ECD

PC5

FL1

100%

1.1%

0.4%

0.2%

FL2

12.3%

100%

12.7%

4.5%

FL3

3.6%

36.8%

100%

2.4%

FL4

1.0%

9.5%

36.9%

100%

Prof. Doutor José Cabeda

slide41

Uncompensated vs Compensated

FL2

FL1

Prof. Doutor José Cabeda

slide42

COMPENSATION IS INTENSITY DEPENDENT

FL2

FL1

fully compensated

uncompensated

partially compensated

Prof. Doutor José Cabeda

slide43

COMPENSATE INSTRUMENT USING STAINED CELLS

1. Adjust PMT voltages using unstained cells

2. Adjust compensation for each fluorochrome

Prof. Doutor José Cabeda