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絶対値発光量測定法と ホタルの量子収率

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絶対値発光量測定法と ホタルの量子収率. 東大物性研 A , CREST ・ JST B , アトー C ,  産総研 D ,  静岡大 E 安東頼子 A,B , 山田展之 C , 入江勉 C , 榎本敏照 C , 久保田英博 B,C 丹羽一樹 E , 近江谷克裕 D,E , 秋山英文 A,B. Motivation. ホタルルシフェリン発光量子収率 初報告 88±25% (pH 7.6) by Seliger & McElroy in 1969

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絶対値発光量測定法とホタルの量子収率

東大物性研A,CREST・JSTB, アトーC, 産総研D, 静岡大E

安東頼子A,B, 山田展之C, 入江勉C, 榎本敏照C, 久保田英博B,C

丹羽一樹E, 近江谷克裕D,E, 秋山英文A,B

motivation
Motivation
  • ホタルルシフェリン発光量子収率 初報告

88±25% (pH 7.6) by Seliger & McElroy in 1969

H. H. Seliger, W. D. McElroy, Arch. Biohem. Biophys, 88, 136 (1969).

  この値を出した実験に用いられたサンプルが劣化(ラセミ化)していた可能性がある事を

  同じグループが後に報告している。

  しかし、現在まで追試が行なわれてこなかった。

  • ホタルルシフェリンBioluminescenceの発光色決定機構については

  諸説あるが、まだ解明されていない

   発光スペクトルがpHやホタルルシフェラーセ(酵素)の種類によって変化する

→ 発光量子収率を測定

  → 発光スペクトルの定量解析により、発光色決定機構に関する   インフォメーションを得る

outline
Outline

ホタルルシフェリン Bioluminescence

  • 発光量子収率
  • Photon Yield スペクトル
  • 発光スペクトル pH依存性の定量解析
  • 発光減衰時間 

絶対値発光量測定

  • セルの集光効率較正法
slide4

 測定系の較正

①セルの集光効率 

②測定系のスループット

③検出器の絶対感度

Measurements

溶液からの生物・化学発光 絶対値発光量測定系

slide5

LH2+ ATP + LUC LUC・LH2-AMP + PPi

Mg2+

LUC・LH2-AMP + O2 →

LUC・AMP・Oxyluciferin* + CO2

LUC・AMP・ Oxyluciferin* →

LUC + Oxyluciferin + AMP + hν

ホタルルシフェリン発光過程

M. DeLuca, Firefly luciferase, Adv. Enzymol. 44, 37 (1976).

B.R. Branchini, et al., J. Ame. Chem. Soc., 43, 7255 (2004).

slide6

発光量子収率 pH依存性

発光量子収率 = 放出された総フォトン数 / ルシフェリン分子数

TrisQY± 測定のバラツキ

pH 8.5 40.7 ± 1.1 %

pH 8.1 40.1 ± 1.0 %

*測定系較正での誤差の見積もり

±18%

発光量子収率

40.7 ± 7.3 % (pH 8.5)

slide7

ホタルルシフェリンの発光スペクトルは

3成分のガウス分布によって再現出来る

Photon Yield スペクトル

*縦軸は光子数(/eV)を表す。

  スペクトルを積分し、その値を分子数で

  割った値が量子収率である。

Peak Energy

peak a 2.2 eV (560nm)

peak b 2.0 eV(620nm)

peak c 1.85 eV(670nm)

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発光スペクトル 定量解析

Peak Energy

半値全幅

量子収率

Total 量子収率 (QY)

pH依存性 あり

Peak a QY

Peak b QY

pH依存性 殆ど無し

Peak c QY

Total QYの pH依存性は

peak a 成分由来

slide9

発光減衰時間 pH依存性

発光減衰

  • pH
  • Luciferase, ATP, Mg2+ 濃度
  • Bufferの種類
  • によって発光減衰時間は著しく変わる。
  • 一方、量子収率はpHに依存する。

発光減衰時間

それぞれを決定する要因

発光減衰時間→上記によって決まる反応時間

  量子収率 → オキシルシフェリンの

発光効率 pH依存性

slide10

発光スペクトルshape pH依存性

pH 7.8 – 8.9

 “Yellow-green emission”

pH 6.5 – 7.5

pHの減少と共にpeak a成分が減少

pH < 6.0

“Red emission”

規格化 発光スペクトル

  • 発光色決定機構に関係する事
  • pH 7.8 – 8.5はPeak a成分が最も
  • 発光収率が高い領域である
  • pHが下がるごとにpeak a 成分の発光
  • に阻害が掛かるのか?!
  • pH 6.0付近ではRed emission のみの
  • 発光が観測される
slide11

N

S

S

N

-O

O

H+

S

N

S

N

-O

O-

Keto-form

enolate-form

Φ

N

S

Twisted keton

N

S

O

-O

発光色決定の諸説
  • モノアニオン・ジアニオン説

発光生成物オキシルシフェリンの励起一重項状態

モノアニオン → Red emission

    ↑↓±H+

  ジアニオン → Yellow-green emission

McCapra, R. and D. G. Richardson, Tetrahedron Lett., 3167-3172 (1964).

  • 回転角説

C2-C2’ bondの回転によって発光色が変わる

MaCapra, F., Gilfoyle, D. J., Young, D. M., Church, N. J., Spencer, P.,

Bioluminescence and Chemiluminescence, John Wiley & Sons, p387 (1994).

  • オキシルシフェリンのpolarization説

Luciferaseに取り込まれているオキシルシフェリンの電子状態によって決まる

Ugarova, N. N., Brovko, L. Y., Luminescence, 17, 321 (2002).

etc…

slide14

様々なセルの集光効率

集光効率 液量依存性

*色が付いているセル(white, Black等)は

  反射率 波長依存性を考慮する必要あり

*348-well microplate →

full : 100ul

slide15

まとめ

  • ホタルルシフェリンの量子収率は、pH 8.5, 8.0 付近で最も高い値を示し、40.7±7.3% (Tris pH8.5) であった。
  • 量子収率はpHの減少と共に値が小さくなり、pH 5.5以下では発光が見ら

れなくなる。

  • Photon Yield スペクトル測定により、スペクトル変化のpH依存性と定量的

に解析する事が出来た。その結果、2.2eV付近に ピーク をもつ発光成分の

  pH依存性が量子収率、スペクトル変化に影響を与えている事が分かった。

  • 発光減衰時間を決めている要因と、量子収率を決めている要因は別である。量子収率は、オキシルシフェリンの励起発光効率によって決まる。