生物技术综合实验 Comprehensive experiments of biotechnology

1. 生物技术综合实验 Comprehensive experiments of biotechnology

2. 主要内容 Contents： 一、课程简介 核酸的分离与纯化 Isolation and Purification of Nucleic Acid 二、电泳技术 Agarose Gel Elrctrophoresis and SDS-PAGE 三、聚合酶链式反应技术 Polymerase Chain Reaction 四、DNA序列测定 DNA Sequencing 五、分子杂交技术 Molecular Hybridization － Southern,Northern and Western Blot 六、基因文库和cDNA文库的构建 Construction of cDNA Library and DNA Library 七、外源基因的克隆与表达Heterogenic Gene Cloning and Expression 八、蛋白质的分离、纯化技术 Isolation and Purification of Protein

3. Part 5 分子杂交 Molecular Hybridization (DNA,RNA & protein) 核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的基本技术方法之一。 杂交是指亲源关系相近的不同来源的DNA单链或DNA单链与RNA单链之间通过碱基互补形成杂交分子的过程。 其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下(适宜的温度及离子强度等)可按碱基互补原则退火形成双链。此杂交过程是高度特异性的。

6. 杂交的双方是待测核酸序列及探针。待测核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。将核酸从细胞中分离纯化后可以在体外与探针杂交(膜上印迹杂交)，也可直接在细胞内进行(细胞原位杂交)。杂交的双方是待测核酸序列及探针。待测核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。将核酸从细胞中分离纯化后可以在体外与探针杂交(膜上印迹杂交)，也可直接在细胞内进行(细胞原位杂交)。

7. 用于检测的已知核酸片段称之为探针(probe)。为了便于示踪（检测杂交信号），探针必须用一定的手段加以标记，以利于随后的检测。常用的标记物是放射性核素，近年来也发展了一些非放射性标记物。

8. 由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的高度灵敏性，使得核酸分子杂交技术在分子生物学领域中被广泛应用于：由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的高度灵敏性，使得核酸分子杂交技术在分子生物学领域中被广泛应用于： • 基因克隆的筛选 • 基因表达水平的定性和定量检测 • 基因组中特定基因序列的定性和定量检测 • 基因突变分析 • 疾病的诊断

9. 本部分重要内容 • 核酸分子探针的标记 ：放射性标记、非放射性标记 • 核酸分子杂交：膜上印迹杂交、液相杂交、原位杂交

10. 一、核酸分子探针的标记 (labeling of probe) （一）概述 在化学及生物学意义上的探针(probe)，是指能与特定的靶分子发生特异性相互作用的分子，并可以被特殊的方法所探测。 例如抗体—抗原、生物素—抗生物素蛋白、激素—受体等的相互作用都可以看作是探针与靶分子的相互作用。

11. 所谓核酸分子探针则是指特定的已知核酸片段，能与互补核酸序列退火杂交，然后用特定的方法进行杂交信号的检测。从而可以用于待测核酸样品中特定基因序列的探测。所谓核酸分子探针则是指特定的已知核酸片段，能与互补核酸序列退火杂交，然后用特定的方法进行杂交信号的检测。从而可以用于待测核酸样品中特定基因序列的探测。

12. 探针的选择与特异性 • 核酸探针分为两种类型： 克隆探针与合成的寡核苷酸探针 克隆探针序列较长、复杂性大。随机性小，特异性高 合成的寡核苷酸探针相对较小，18-50bp，G,C含量在40-60%之间，探针内不含互补区，探针内不含一个碱基的多次重复（长度4）如GGGGG等。

13. （二）探针的种类 • 根据核酸分子探针的来源及其性质可以分为： • 基因组DNA探针 • cDNA探针 • RNA探针 • 人工合成的寡核苷酸探针 根据研究目的不同，可以采用不同类型的核酸探针。探针选择正确与否，将会直接影响到杂交结果的分析。

14. 要实现对核酸探针分子的有效探测，必须将探针分子用一定的示踪物(即标记物)进行标记。要实现对核酸探针分子的有效探测，必须将探针分子用一定的示踪物(即标记物)进行标记。 核酸分子探针的标记是核酸分子杂交的基础。

15. （三） 各种标记物及其选择 1.理想的探针标记物，应具备以下几种特性 ①检测方法要有高度灵敏性，同时应具有高度特异性，尽量减低假阳性率。 ②标记物与核酸探针分子的结合，应不影响探针分子的主要理化特性，特别不应影响杂交特异性和杂交稳定性；

16. ④标记反应的效率和标记产物的比活性应较高；④标记反应的效率和标记产物的比活性应较高； ⑤如果要求更严一些，它还应具有较高的化学稳定性，保存时间较长，标记及检测方法简单；对环境无污染，对人体无损伤；价格低廉等。

17. 2.几种常见的探针标记物 （1）放射性同位素 • 优点：放射性核素与相应的元素具有完全相同的化学性质，因此对各种酶促反应无任何影响，也不会影响碱基配对的特异性与稳定性和杂交性质。另外放射性同位素的检测具有极高的特异性，极少出现假阳性结果。

18. 主要缺点：易造成放射性污染；不够稳定（有半衰期）。主要缺点：易造成放射性污染；不够稳定（有半衰期）。

19. 放射性同位素与相应的元素具有完全相同的化学性质，是因为二者之间的差别只在中子数目上，质子和电子数完全一致，而元素的化学性质是由其核外电子决定的，放射性同位素与相应的元素具有完全相同的化学性质，是因为二者之间的差别只在中子数目上，质子和电子数完全一致，而元素的化学性质是由其核外电子决定的， 例如：32p、35S、3H、125I等。

21. （2）非放射性标记物 • 优点：无放射性污染、较稳定（可以较长时间保存，从而更便于临床诊断应用）。 • 缺点：灵敏度和特异性都不太高。

22. 3 根据检测方法不同分以下几种 • 荧光素：异硫氰酸荧光素（FITC）、罗丹明类等。 • 半抗原：生物素、地高辛等。 • 化学发光类：如 Lightsmith Ⅱ Luminescence Engineering System (Promega) • 光密度或电子标记物：如金、银等。

23. （四）探针的放射性同位素标记 1.双链DNA探针的标记 （1）切口平移法(nick translation) （2）随机引物法(Random Primer Labeling) （3）末端标记法(terminal labeling)

24. 2.单链DNA探针的标记（采用DNA polymeraseⅠ Klenow片断催化合成） 3.cDNA探针的标记（反转录合成） 4.RNA探针的制备与标记（采用RNA聚合酶 合成）

25. RNA探针的制备与标记-T7/SP6 polymerase system . Inserted gene Transcription start site linearized T7 promoter T7 or SP6 RNA polymerase, NTP, [–32p]-UTP, ~CTP DNase –32p labeled RNA probe

26. cDNA探针的标记 AAAAAAAAAAAAAA Poly(A) mRNA TTTTTTTTT Oligo(dT) or Random Primer AAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTT AMV, [–32p]-dNTP , dNTP AAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTT RNA/DNA hybrid Denature, isolation by Sephadex G-50 TTTTTTTTT

27. cDNA探针的标记 . AAAAAAAAAAAAAA Poly(A) mRNA TTTTTTTTT Oligo(dT) or Random Primer AAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTT AMV, [–32p]-dNTP , dNTP AAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTT RNA/DNA hybrid Denature, isolation by Sephadex G-50 TTTTTTTTT

28. 单链DNA探针的标记 Universal primer or downstream primer Inserted gene . M13 Klenow fragment [–32p]-dNTP Restriction endonuclease Denature isolation Single strand DNA probe

29. 切口平移法(nick translation labeling) 5’ 3’ 3’ 5’ DNase I, Mg2+ 5’ 3’ 3’ 5’ DNA polymerase I, [–32p]-dNTP 5’ 3’ 3’ 5’ denature 切口原始位置 切口最终位置

30. 随机引物法(Random Primer Labeling) 5’ 3’ 3’ 5’ denature 3’ 5’ Random Primer 3’ 5’ Klenow DNA polymerase [–32p]-dNTP 3’ 5’ denature

31. 末端标记法(terminal labeling) 5’ 3’ dsDNA 5’ Restriction endonuclease 5’ 3’ 3’ 5’ Klenow DNA polymerase –32p-dNTP 5’ 5’ denature

32. Cloning a segment of DNA into a plasmid vector PstI Human DNA cut with PstI P pBR322 ampR, tetR ampR tetR P P combine and ligate P tetR pBR322 DNA cut with PstI inactivating the ampR gene tetR pBR322 (human clone) tetR • bacteria are “transformed” with the recombinant plasmid • colonies that grow in tetracycline, but not in ampicillin are isolated

33. （五）探针的非放射性标记法 按照标记方法的不同，现有的非放射性标记物主要有两种类型： 1.标记物预先已连接在NTP或dNTP上，因此可像放射性核素标记的核苷酸一样用酶促聚合方法掺入到核酸探针上，如生物素、地高辛等； 2.标记物直接与核酸进行化学反应而连接在核酸上。此后一类标记物标记过程更为简单，可能是今后研究发展的主流。

34. 二、核酸分子杂交 • 膜上印迹杂交 • 液相杂交 • 原位杂交

35. （一）膜上印迹杂交 其操作基本流程是：首先用凝胶电泳方法将待测核酸片段分离，然后用印迹技术将分离的核酸片段转移到特异的固相支持物上，再用标记的核酸探针与固相支持物上的核酸片段进行杂交，然后洗去未杂交的游离的探针分子，最后检测杂交信号。 由于探针已与待测核酸片段中的同源序列形成杂交分子，探针分子显示的位置及其量的多少，则反映出待测核酸分子中是否存在相应的基因顺序及其量与大小。

36. 1.印迹技术 印迹技术是指将待测核酸分子结合到一定的固相支持物上的方法，这些结合在固相支持物上的核酸分子即可与存在于液相中的探针分子进行杂交。 选择良好的固相支持物与有效的转移方法是此项技术成败的两个关键因素。

37. 1.1 固相支持物的选择 一种良好的固相支持物应具备以下几个特性： ①具有较强的结合核酸分子的能力，一般要求每平方厘米结合核酸分子的量不应低于10ng，最好能达到数十微克； ②与核酸分子结合后，应不影响其与探针分子的杂交反应； ③与核酸分子的结合稳定牢固，能经受杂交、洗膜等操作过程而不至于脱落或脱落极少；

38. ④非特异性吸附少，在洗膜条件下能将非特异性吸附在其表面的探针分子洗脱掉；④非特异性吸附少，在洗膜条件下能将非特异性吸附在其表面的探针分子洗脱掉； ⑤具有良好的机械性能，如柔软性好、韧性强等，以便于操作。 以下介绍最常用的几种固相支持物。

39. (1)硝酸纤维素滤膜(nitrocellulose filter membrane)： • 优点： • 杂交信号本底较低; • 非特异性地吸附蛋白质的作用较弱，因此特别适合于那些涉及蛋白质作用(如抗体和酶等)的非放射性标记探针的杂交体系。

40. 缺点： 因为硝酸纤维素膜是依靠疏水性相互作用结合DNA的，这种结合并不十分牢固，随着杂交及洗膜的进程，DNA会慢慢脱离硝酸纤维素膜，特别是高温情况下，从而使杂交效率下降。因此不太适宜于在同一膜上重复进行杂交。再者，硝酸纤维素膜质地较脆，特别是经烘烤后，操作不方便，须特别小心。

41. (2)尼龙膜(nylonmembrane)： 尼龙膜是目前较理想的一种核酸固相支持物，它有多种类型，除网眼大小不一样外，有的尼龙膜未经特殊处理，有些则是经过了正电荷基团的修饰。这种修饰的尼龙膜结合核酸的能力更强。

42. 优点： • 结合核酸的能力强，对于小分子量DNA片段(特别是<200bp的DNA片段)现在更多的人倾向于使用尼龙膜。 • 尼龙膜可重复用于杂交，一次杂交后，探针分子可经碱变性而被洗脱下来，从而可用于与第二探针进行杂交。 缺点：杂交信号本底较高，可以用加大预杂交液中的非特异性封闭试剂的方法克服。

43. (3)化学活化膜(chemical activated paper)：将滤纸用一定的化学物质处理后即形成化学活化膜(如ABM和APT纤维素膜)。 优点：①DNA与膜共价结合，因此反复多次使用不会有太多的损耗；②对不同大小的核酸片段都具有同等的结合能力，这是硝酸纤维素膜及尼龙膜都不具备的。 但其结合能力一般较硝酸纤维素膜要低，活化过程较复杂，因此较少为人们所使用。

44. 1.2 印迹方法 印迹的方法有多种： ①可直接将核酸样品点样于固相支持物上，称为斑点或狭缝印迹法； ②利用毛细管虹吸作用由转移缓冲液带动核酸分子转移到固相支持物上； ③利用电场作用的电转法； ④利用真空抽滤作用的真空转移法。

47. 根据待检测的核酸类型不同，分为Southern印迹法和Northern印迹法。根据待检测的核酸类型不同，分为Southern印迹法和Northern印迹法。 • Southern印迹法是指将电泳分离的DNA从凝胶中转移到固相支持物上的过程。 • Northern印迹法则是指将电泳分离的RNA 从凝胶中转移到固相支持物上的过程。

48. 1.3 固-液相杂交技术 • 在固相杂交中，未杂交的游离片段可容易地漂洗除去，膜上留下的杂交物容易检测和能防止靶DNA自我复性等优点，所以比较常用。常用的固相杂交类型有：菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、Southern印迹杂交、组织原位杂交和夹心杂交等。

49. 1.3 固-液相杂交技术 （1）基本原理 双链DNA在一定的条件下(适宜的温度及离子强度等)变性，具有一定同源性的两条核酸单链可按碱基互补原则退火复性形成双链的过程。 （2）杂交体系的建立

50. 建立杂交体系应考虑到以下几个因素： （1）离子强度：一般杂交体系中离子强度为5×或6×SSC(1xSSC为0.15mol/L NaCI和0.015mol/L 柠檬酸钠)。 （2）DNA浓度：DNA浓度愈高，复性速度愈快。为保证足够的DNA浓度，除应加入足够的DNA量外，还应尽量减少杂交体积，一般以每平方厘米滤膜面积加50-100μl杂交液为宜。