生物技术综合实验 Comprehensive experiments of biotechnology

1. 生物技术综合实验 Comprehensive experiments of biotechnology

2. 主要内容 Contents： 一、课程简介 核酸的分离与纯化 Isolation and Purification of Nucleic Acid 二、电泳技术 Agarose Gel Elrctrophoresis and SDS-PAGE 三、聚合酶链式反应技术 Polymerase Chain Reaction 四、DNA序列测定 DNA Sequencing 五、分子杂交技术 Molecular Hybridization － Southern,Northern and Western Blot 六、基因文库和cDNA文库的构建 Construction of cDNA Library and DNA Library 七、外源基因的克隆与表达Heterogenic Gene Cloning and Expression 八、蛋白质的分离、纯化技术 Isolation and Purification of Protein

3. 7 外源基因的克隆与表达Heterogenous Gene Cloning and Expression

4. 基因工程诞生的历史背景: 1.核酸是生物遗传物质的实验证据（Avrey,1944） 2.DNA结构双螺旋模型 (Watson & Crick, 1953) 3.DNA遗传密码的破译（1961～1966，Nineberg & Crick ） 4.发现反转录酶(Baltimore & Temin, 1970) 5.染色体外遗传单位——质粒的深入研究(Lederberg, 1950-1970) 6.发现DNA限制性内切酶（1968-1970，Arber，Smith和Nathans） 7. DNA体外重组（ Cohen等，1973）

6. 1972 Paul Berg & Herb Boyer Produced the first recombinant DNA molecules. They Shared the 1980 Nobel Prize in Chemistry "for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids, with particular regard to recombinant-DNA", Paul Berg Herb Boyer

7. 1973年是基因工程的元年。 这座里程碑的树起，凝聚着几代科学家的心血与努力，他们在理论与技术上的卓越贡献，为基因工程的诞生奠定了坚实的基础。

8. 一、基因克隆的策略与技术路线 1.基因克隆的策略 克隆原指一个亲本细胞产生成千上万个相同细胞组成的群体的过程。 在分子水平，为了达到大量获取同一基因或基因的表达产物这一目的，采取体外进行靶DNA分子与某一微生物载体杂合，导入宿主细胞，通过自主复制而产生大量相同的基因或基因产物。这是目前基因克隆的主要策略。

9. 克隆外源DNA基本流程图示

10. 2. DNA克隆技术涉及的主要过程与方法 （1）分离制备待克隆的DNA片段； （2）将靶DNA片段与载体在体外进行连接； （3）重组DNA分子转入宿主细胞； （4）筛选、鉴定和扩增阳性重组子；

11. 2.1 分离制备待克隆的DNA片段的方法 （1）用DNA限制性内切酶切割细胞DNA，然后分离所需要的DNA片段（原核基因）； （2）从细胞中分离所需要的mRNA，通过反转录合成cDNA（真核基因）； （3）用化学法人工合成DNA。

12. 2.2 靶DNA片段与载体的连接 2.2.1 载体的选择与改造应具备下几个条件： (1)载体上应具备完成实验目的的最基本元件：如载体上应具有适当的启动子、终止子等。

13. (2)载体上有一些对于它们在宿主中增殖非必需的DNA区域，并包含单个内切酶位点（多克隆位点），以便外源DNA能够通过共价连接插入或取代该区段，形成的重组子可在宿主细胞中复制和增殖。(2)载体上有一些对于它们在宿主中增殖非必需的DNA区域，并包含单个内切酶位点（多克隆位点），以便外源DNA能够通过共价连接插入或取代该区段，形成的重组子可在宿主细胞中复制和增殖。 (3)载体分子量不宜过大，以便于DNA体外操作，同时载体DNA与宿主核酸应容易分开，便于提纯。

14. (4)载体应具有筛选标记，以区别阳性重组分子和阴性重组分子。选择标记包括抗药性基因、酶基因、营养缺陷型及形成噬菌斑的能力等。(4)载体应具有筛选标记，以区别阳性重组分子和阴性重组分子。选择标记包括抗药性基因、酶基因、营养缺陷型及形成噬菌斑的能力等。 (5)对于表达型载体还应配备与宿主细胞相适应的启动子、信号肽序列、 SD顺序、加尾信号、增强子等调控元件。

15. 2.2.2 DNA的连接 限制性内切酶处理DNA后，一般产生粘性末端、平末端两种形式。 两个DNA片段有以下几种出现方式： ①两个不同的粘性末端； ②两个相同的粘性末端； ③一个粘性末端一个平末端； ④两个平末端。 注意：提高连接效率、降低假阳性！

16. 2.3 重组DNA分子（重组子）转入宿主细胞 • 受体细胞也称宿主，是重组子扩增及表达的场所，分为原核细胞和真核细胞两类。 • 原核细胞主要是大肠杆菌、链霉菌及枯草杆菌等（原核细胞不但是重组子复制扩增的场所，也可以作为外源基因的表达系统）。 • 真核细胞包括酵母、哺乳动物细胞及昆虫细胞等。

17. 宿主细胞是基因克隆载体的增殖场所，对于一个适当的宿主细胞，具有以下几个要求：宿主细胞是基因克隆载体的增殖场所，对于一个适当的宿主细胞，具有以下几个要求： ①对重组子的复制和扩增没有严格的限制； ②不存在特异的内切酶体系降解重组子； ③在重组子增殖过程中，不对载体DNA进行修饰； ④不会产生载体DNA的体内重组； ⑤容易导入重组子； ⑥符合“重组DNA操作规则”的安全标准。

18. 在基因克隆技术中，重组子导入受体细胞有两个概念：在基因克隆技术中，重组子导入受体细胞有两个概念： • 转化(transformation or introduction)：特指以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。 • 转染(transfection)：是指噬菌体、病毒或以它作为载体构建的重组子导入细胞的过程。

19. 高效率感受态细胞的制备（氯化钙转化法）: 操作步骤 ( protocol)： (1)将宿主菌在琼脂培养基平板上划线，37℃培养16—20小时。 (2)从平板中取出1个2-3mm大小的单菌落，移至含100ml LB培养基的500ml 三角瓶中，37℃ 280rpm/min强烈振荡培养3小时，使细胞的浓度达到对数生长期或对数生长前期，细菌的OD.600一般在0.2—0.4之间。 (3)将培养物于冰上放置10分钟，然后转移到两个50ml离心管中，4000rpm/min，4℃离心10分钟。

20. (4)弃上清，倒置离心管1分钟，流尽剩余液体，然后加人10ml用冰预冷的0.1mmol/L CaCl2溶液悬浮细胞，置于冰上10分钟。 (5)4000rpm/min，4℃离心10分钟回收细胞，弃上清，每50ml的原培养物再加入2ml冰冷的0.1mmol/L CaCl2溶液，悬浮细胞。 (6)按每份200ul分装细胞，若不马上进行转化，该感受态细胞可以加入终浓度为10％的灭菌甘油，置于-70℃冻贮。

21. 转化( transformation)： a．用新鲜制备的（或从-80℃冰箱中取出置冰上5分钟至刚好解冻的）感受态细菌100μl感受态细菌至预冷管中。 b．加入1-50ng DNA，用微量移液器吸头搅动两次，以便DNA扩散均匀，用手指弹动管壁数次。 c．马上放置冰上30分钟。

22. d．42℃水浴热休克45～50秒，注意不要摇动离心管。d．42℃水浴热休克45～50秒，注意不要摇动离心管。 e．迅速置冰上2分钟。 f．加入900μl室温的LB培养基，37℃、225rpm/min摇荡，振荡培养60分钟。 g．取100—200μl转化菌涂布平板幻灯片 29（含有筛选物质），过夜培养。

23. 2.3 筛选、鉴定阳性重组子 基因克隆的最后一道工序就是从转化细菌菌落中筛选含有阳性重组子的菌落并鉴定重组子的正确性，通过细菌培养以及重组子的扩增，从而获得所需基因片段的大量拷贝，进一步研究该基因的结构、功能或表达该基因的产物。

24. （1）针对遗传表型改变筛选法 • 抗生素平板筛选 • 插入失活双抗生素对照筛选 • β-半乳糖苷酶系统筛选 • ……

25. （一）pBR322质粒是4362bp的环状双链DNA载体，有2个抗药性基因（四环素和氨苄青霉素），一个复制起始点和多个用于克隆的限制酶切点。当缺失抗药性基因的大肠杆菌被pBR322成功地转化时，它便从该质粒获得了抗生素抗性。两个抗生素基因中均含供插入外源DNA用的不同的单一酶切位点。一般只选一个抗生素基因作为插入外源DNA之用。外源DNA插入后该抗生素抗性失活。另一抗生素抗性基因则作为转化细菌后筛选阳性克隆之用。（一）pBR322质粒是4362bp的环状双链DNA载体，有2个抗药性基因（四环素和氨苄青霉素），一个复制起始点和多个用于克隆的限制酶切点。当缺失抗药性基因的大肠杆菌被pBR322成功地转化时，它便从该质粒获得了抗生素抗性。两个抗生素基因中均含供插入外源DNA用的不同的单一酶切位点。一般只选一个抗生素基因作为插入外源DNA之用。外源DNA插入后该抗生素抗性失活。另一抗生素抗性基因则作为转化细菌后筛选阳性克隆之用。

26. （二）pUC系列质粒是2.7Kb的双链DNA质粒，有一个复制起点，一个氨苄青霉素抗性基因和一个多克隆位点，多克隆位点处于表达LacZ基因产物-β-半乳糖苷酶的氨基端片段，用pUC质粒转化LacZ基因有突变的大肠杆菌株（M15）时，因为由质粒表达的α－肽补充了大肠杆菌却失的α－肽，所以恢复了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和X-gal的培养基上，长出蓝色克隆。如果在多克隆位点内插入外源DNA，由于它破坏了α－肽的表达，因而在加入IPTG和X－gal的培养基，不能长出蓝色克隆，这就是所谓的蓝白筛选。幻灯片 30

27. (2)分析重组子结构特征的筛选法 • 快速裂解菌落电泳鉴定 • 内切酶图谱鉴定 • Southern印迹杂交 • PCR筛选重组子 • 菌落(或噬菌斑)原位杂交 • 测序

28. 3 工程菌表达及条件的优化 • 诱导时间(30’ 1h 2h 3h 4h 5h 6h) • 诱导条件的优化 化学诱导(IPTG) 温控诱导(42 ) • pH、补料、化学物质（SDS）等。

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