3èmes Journées de formation du Réseau des Centres Commun de Microscopie

1. 3èmes Journées de formation du Réseau des Centres Commun de Microscopie Université de Rouen- Maison de l’université 3 et 4 Juin 2004 Utilisation du Cryo-SEM pour l’étude du fonctionnement hydraulique des plantesHervé Cochard, Christian Bodet UMR-PIAF, INRA, Clermont-Ferrand

2. Le Cryo-SEM en qqes mots: • SEM classique (Philips SEM 505) • Étage cryogénique T < -80°C (Hexland CT 100) • Observation • Métallisation • En dessous du point de sublimation de la glace • Observation d’échantillons hydratés mais congelés • Hypothèse: le mode préparatoire des échantillons ne perturbe pas leur observation (méthode directe)

3. Utilisation du Cryo-SEM dans le domaine végétal Épiderme d’une feuille Photos: C Bodet

4. Utilisation du Cryo-SEM dans le domaine végétal Coupe d’une feuille (cryo-fracture) Photos: C Bodet

5. Utilisation du Cryo-SEM dans le domaine végétal Anatomie d’une aiguille de Pin

6. Sève brute Eau Ascendante Xylème H2O CO2 Sève élaborée Riche en sucres Descendante Phloème Circulation des sèves dans l’arbre Croissance de l’arbre

7. Déformation de la paroi des vaisseaux (collapse) Présence de bulles d’air dans les vaisseaux conducteurs (embolie) Collapsé Normal From: Piquemal et al 1998 Deux phénomènes à mettre en évidence

8. Observation du xylème au SEMÉchantillons prélevés et déshydratés

9. Observation du xylème au cryo-SEMRisques de sublimation de la glace(cryo-décapage ou métallisation)

10. Cryo-fracture Cryo-microtome Observation du xylème au cryo-SEMÉchantillons prélevés puis congelés LN2 Betula platyphylla, Utsumi et al 1998

11. La nombre de vaisseaux embolisés dépend du point d’observation Pétiole de Noyer Nombre de vaisseaux embolisés millimètres Distance à la coupe Tyree, Cochard, Cruiziat PCE 2003.

12. Évaporation Feuilles: Surface poreuse Xylème: Tubes Parois rigides Sol : Eaudiluée Circulation de la sève brute Feuilles : Pompe aspirante

13. Un système vasculaire sous tension (dépression) • La sève brute est aspirée par dépression • La « pompe aspirante » se désamorce • L’appareil vasculaire s’embolise Sol : Eaudiluée

14. Perturbation du contenu des vaisseaux lors du prélèvement des échantillons L’appareil vasculaire est constitué de conduits de dimensions variables mais finies Photo: C Bodet, INRA-PIAF vaisseau Terminaison de vaisseau La sève se retire sur toute la longueur des vaisseaux

15. LN2 Cryo-SEM Observation du xylème au cryo-SEMÉchantillons congelés sur l’arbre puis prélevés Cochard et al Plant Physiol 2000

16. Observation du xylème au cryo-SEMÉchantillons congelés sur l’arbre puis prélevés

17. Le paradoxe du Cryo-SEM 10 µm -0.7 MPa -0.7 MPa >-0.03 MPa! Les mesures de tension de sève sont-elles erronées ? Les observations au cryo-SEM sont-elles erronées ?

18. Cryo-SEM LN2 Water Importance du mode préparatoire des échantillons Échantillons recoupés sous eau puis congelés

19. Variations journalières d’embolie dans un pétiole de noyer LN2 Water +

20. Artéfact de congélation Vitesse de congélation des échantillons par LN2 T,°C LN2

21. LN2 Étude des phénomènes de collapse Collapsus des parois Cochard et al, Plant Physiol 2004

22. Mise en évidence du phénomène de collapse par cryo-SEM dans des aiguilles de Pinus cembra Aiguille bien hydratée

23. Aiguille fortement déshydratée Pinus cembra -4 MPa

24. Aiguille très fortement déshydratée Pinus cembra -4.6 MPa

25. Importance du mode préparatoire des échantillons LN2 LN2 Eau 2 min

26. Conclusions • Pour le xylème: la fiabilité des observations est très dépendante de la préparation des échantillons. • Possibilités d’artéfacts et d’interprétations erronées des observations. • Embolie : recouper sous eau • Collapse : ne pas recouper sous eau ! • Hypothèse: le mode préparatoire des échantillons ne perturbe pas leur observation ?