Biblioteka BAC genomu
Download
1 / 14

Andrzej Kasprzak Instytut Genetyki Ro?lin PAN, Pozna? Pracownia Genomiki Strukturalnej - PowerPoint PPT Presentation


  • 82 Views
  • Uploaded on

Biblioteka BAC genomu Lupinus angustifolius. Andrzej Kasprzak Instytut Genetyki Roślin PAN, Poznań Pracownia Genomiki Strukturalnej prof. dr hab. Bogdan Wolko. Cel pracy. Konstrukcja biblioteki BAC dla genomu Lupinus angustifolius

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about 'Andrzej Kasprzak Instytut Genetyki Ro?lin PAN, Pozna? Pracownia Genomiki Strukturalnej' - kyrene


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
Andrzej kasprzak instytut genetyki ro lin pan pozna pracownia genomiki strukturalnej

Biblioteka BAC genomu

Lupinus angustifolius

Andrzej Kasprzak

Instytut Genetyki Roślin PAN, Poznań

Pracownia Genomiki Strukturalnej

prof. dr hab. Bogdan Wolko


Cel pracy
Cel pracy

  • Konstrukcja biblioteki BAC

    dla genomu Lupinus angustifolius

  • Charakterystyka biblioteki – czystość, średnia wielkość insertu, reprezentatywność

  • Wykorzystanie biblioteki – przeszukiwanie sondami EST, chromosome painting, chromosome walking


Materia y
Materiały

  • DNA Lupinus angustifolius, izolowany z jąder interfazowych stożków wzrostu korzeni, oczyszczony metodą cytometrii przepływowej

  • Enzym restrykcyjny HindIII

  • Wektor pINDIGOBAC5 (Epicentre)

  • Komórki kompetentne E. coli DH10B

  • Medium selekcyjne (CHl, X-Gal, IPTG)

  • Płytki do przechowywania klonów w temperaturze -80oC, 384-miejscowe


Andrzej kasprzak instytut genetyki ro lin pan pozna pracownia genomiki strukturalnej

Próbka

Puls ładujący próbkę

Detektor

Źródło światła

_

+

Naładowana elektroda

Selekcjonująca krople

Naładowana elektroda

Selekcjonująca krople

Frakcja o ładunku

dodatnim

Frakcja o ładunku

ujemnym

Zanieczyszczenia

1. Izolacja DNA za pomocą

„sortera chromosomów”


Andrzej kasprzak instytut genetyki ro lin pan pozna pracownia genomiki strukturalnej
2. Trawienie DNA w niskotopliwej agarozie (HindIII, 15min, 37°C)3. Selekcja wielkości fragmentów po trawieniu

PFGE: Podwójna selekcja wielkości (w buforze 0. 25 x TBE)

Pierwsza selekcja: 1% żel agarozowy, 1s - 40s, 6h, 6V/cm, kąt 120°

Druga selekcja: 1% żel agarozowy, 2.5s - 4.5s, 12h, 6V/cm, kąt 120°


Andrzej kasprzak instytut genetyki ro lin pan pozna pracownia genomiki strukturalnej

4. Elektroelucja (1,5 h, 1xTAE, 4 V/cm, 4oC)

5. Ligacja z wektorem pIndigoBAC-5 (Epicentre)


Andrzej kasprzak instytut genetyki ro lin pan pozna pracownia genomiki strukturalnej

6. Transformacja E. coli DH10B

(350 V, impuls 4000, 330 F)

7. Selekcja klonów na podłożu stałym z chloramfenikolem, X-gal, IPTG

Płyta typu BioAssay z transformowanymi komórkami bakteryjnymi



Andrzej kasprzak instytut genetyki ro lin pan pozna pracownia genomiki strukturalnej

9. Sprawdzenie średniej długości insertów

- trawienie BAC’ów enzymem NotI

- elektroforeza w pulsującym polu

(1% żel agarozowy, 0,5xTBE , 1s - 40s,

16h, 6V/cm, kąt 120°)


Andrzej kasprzak instytut genetyki ro lin pan pozna pracownia genomiki strukturalnej

Dystrybucja wielkości insertów

Procentowy udział w bibliotece

Długość insertu [kbp]


Andrzej kasprzak instytut genetyki ro lin pan pozna pracownia genomiki strukturalnej

Obliczanie prawdopodobieństwa znalezienia dowolnie wybranej sekwencji nukleotydowej genu w bibliotece BAC

- wzór Clarke’a i Carbona

P - prawdopodobieństwo, że dowolna sekwencja genomowa ma odpowiednik w bibliotece

N - liczba klonów (55 296)

x - średnia długość insertu (100 kpz)

y - wielkość genomu (920 Mpz)


Andrzej kasprzak instytut genetyki ro lin pan pozna pracownia genomiki strukturalnej

10. Test czystości biblioteki – hybrydyzacja z sondami specyficznymi dla mtDNA i cpDNA łubinu

Klucz odczytywania sygnałów

Przykładowa hybrydyzacja z sondą mtDNA

Dwa pozytywne sygnały

na 18 432 klony BAC


Andrzej kasprzak instytut genetyki ro lin pan pozna pracownia genomiki strukturalnej

11. Screening biblioteki sondami EST znakowanymi radioaktywnie – poszukiwanie genu ENOD40

12. Hybrydyzacja in situ wyselekcjonowanego klonu BAC


Andrzej kasprzak instytut genetyki ro lin pan pozna pracownia genomiki strukturalnej

Podsumowanie radioaktywnie – poszukiwanie genu ENOD40

  • Skonstruowano pierwszą bibliotekę BAC

  • dla genomu Lupinus angustifolius

  • Charakterystyka biblioteki:

  • - liczba klonów: 55 296

  • - średnia wielkość insertu: 100 kbp

  • - zanieczyszczenie mtDNA: 0,018%

  • - zanieczyszczenie cpDNA: 0,045%

  • - prawdopodobieństwo znalezienia sekwencji: 99,7%

  • - pokrycie: 6x