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Chapter 6.

Chapter 6. Immunohistochemistry & Immunofluorescence. 면역염색법의 원리 면역염색법이란 ? 항원 - 항체반응를 이용 조직 , 세포내에 존재하는 특정물질을 확인하는 방법 . 면역조직화학적 염색법 (immunohistochemical staining) 면역염색법 (immuno-staining) - 직접법 - 간접법. 직접법 표본내에 존재하는 물질 A 에 대한 항 A 항체 (1 차 항체 ) 를 표본반응시키면 그 항체는 항원 A 와 반응한다 .

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Presentation Transcript

  1. Chapter 6. Immunohistochemistry & Immunofluorescence

  2. 면역염색법의 원리 면역염색법이란 ? 항원-항체반응를 이용 조직, 세포내에 존재하는 특정물질을 확인하는 방법. 면역조직화학적 염색법(immunohistochemical staining) 면역염색법(immuno-staining) - 직접법 - 간접법

  3. 직접법 표본내에 존재하는 물질 A에 대한 항 A항체(1차 항체)를 표본반응시키면 그 항체는 항원A와 반응한다. 표본내에 항원-항체 결합체가 생겨도 항체는 일종의 면역글로부린이기 때문에 현미경하에서의 관찰이 곤란. 어떤 종류의 물질을 항체에 표지하여 항원-항체반응을 시켜서 항원의 국재부위를 확인할 수 있도록 해야 한다. 표지물질의 대표적인 것 형광염료와 peroxidase등의 효소. 간접법 1차 항체에는 표지를 하지 않고, 2차 항체에 표지하는 방법이다. 2차 항체는 1차 항체를 만든 동물의 면역글로부린(IgG)에 대해 다른 동물로부터 만든 항체이다.

  4. Immunohistochemistry & Immunofluorescence • Principle chromogen primary Ab + fluorescence secondary Ab primary Ab Slide Indirect methods (IHC) Direct methods (IF) • Application of IHC & IF • IHC : metabolic product, lympholiferative product, oncology, virus • IF : Renal biopsy

  5. 면역염색법에는 여러종류의 표지물질 가장 많이 사용되고 있는 것은 형광염료와 효소이다. 형광색소에는 FITC(fluorescein isothiocyanate :황녹색 형광)와 TRITC (tetramethylrhodamine isothiocyanate :적등색 형광)가 가장 많이 사용되고 있으며,효소에는 대부분의 경우에 peroxidase가 이용되고 있어서 흔히 효소항체법을 immunoperoxidase염색법이라고 부르고 있다. 표지에 사용하는 효소는 동물에 존재하지 않는 식물이나,세균 등에서 추출한 효소인데, peroxidase는 서양와사비(horseradish)를 주로 사용한다. 이밖에도 acid phosphatase· alkaline phosphatase· glucose oxidase 등이 필요에 따라 응용되어지고 있다. 이런 효소들은 또한 전자현미경적 염색법에도 이용이 가능하다. 예를 들면 peroxidase는 DAB(diaminobenzidine)에 의하여 갈색으로 정색됨과 동시에 그 정색산물이 osmic acid와 반응함으로써 전자현미경적 관찰이 가능하게 된다. peroxidase외에 ferritin·수은화합물·우라늄·금 등도 전자현미경적 염색에 사용되고 있다.

  6. 면역염색법의 발달 항원-항체반응을 조직에 특정물질을 확인하는 면역반응을 가시화하는 방법과 특이성이 높은 항체의 정체법 등 기술적인 문제. 면역반응의 가시화 문제를 해결 최초로 면역염색법의 개발에 성공한 사람은 Coons (1941). 표지물질로서 형광색소를 이용한 형광항체를 개발, 이 방법은 1974년대에 효소항체법이 보급되기까지의 약 30년간에 걸쳐 병리검사 분야의 유일한 면역염색법으로서 중요한 역할. 1960년 전후에는 여러 종류의 금속화합물이 표지물지로서 개발되어 주로 전자현미경적 면역염색법에 응용. 1970년 후반에 Nakane등에 의해 peroxidase를 이용한 효소항체법이 개발되어 광학현미경 및 전자현미경적 면역염색법이 가능 acid phosphatase· alkaline phosphatase· glucose oxidase 등도 개발되어 사용. 1975년에는 Sternberger등에 의하여 비표지항체법인 PAP법이 개발되었고 이어서 같은 목적으로 역시 비표지항체법인 protein A법과 ABC법이 개발되어 면역염색법이 병리검사에 일반적인 검사법 정착. 이상의 방법들 중 오늘날 병리검사실에서 이용하는 염색법으로는 효소항체법과 PAP 및 ABC방법등의 비표지항체법이 주류를 이루고 있다.

  7. 항원과 항체 일반적으로 항체란 바이러스나 세균과 같이 인체에 유해한 물질의 자극에 의해서만 형성된다고 생각하기 쉬우나, 면역이란 자기자신과 자기자신이 아닌 것을 구분하는 것을 기본으로 하기 때문에 혈액순환을 하는 모든 생물을 자신(개체)을 구성하고 있는 물질이 아닌 이질체(foreign body)가 주입되면 이를 구분하고 이질체를 제거하기 위한 반응을 나타낸다. 이런 방어반응 가운데 하나가 항체(antibody)의 생성이다. 따라서 사람의 어떤 세포성분(X)을 순수하게 정제하여 생쥐나 토끼등에 주입하면 X에 대한 항체 즉, anti-X를 얻을 수 있다. 최근에는 펩타이드와 같은 작은 분자도 순수하게 분리하여 정제할 수 있게 됨에 따라 면역조직화학적인 방법으로 수많은 세포구성 성분의 존재 여부와 존재위치를 정확하게 증명할 수 있게 되었다.

  8. 항원(Antigen) 항원이란 동물에 투여하여 항체 형성을 일으키고, 그 항체와 특이적으로 반응하는 물질(항원물질) 또는 그 물질의 특정 구조(항원구조)라 정의하며, 분자구조가 확실한 것과 아직 불확실한 것을 포함하여 단백질, 다당류, 지질, 핵산 등 가지각색이며, 분자량도 큰 것은 수백만에서 작은 것은 1,000이하까지 다양한 종류가 잇다. 항원의 성질은 항체형성능을 나타내는 면역원성(immunogenicity)과 항체와의 반응성을 나타내는 면역반응성(immunoreactivity)으로 나누며, 양쪽의 성질을 모두 갖추고 있는 것을 완전항원(complete antigen), 면역원성은 없고 면역반응성만을 나타내는 것을 불완전항원(incomplete antigen) 또는 합텐(hapten)이라 부른다. hapten에 대한 항체를 만들기 위해서는 이것에 혈청알부민이나 티로글로부린 등의 완전항원을 항체로 결합시켜 면역에 사용한다. 면역조직화학적으로 어떤 물질을 증명하고자 할 때, 그 물질의 항원성이 손상되지 않으면서 불용성의 안정한 상태로 있는 것이 불가결한 조건이지만, 실제에 있어서는 각종 원인으로 다소 항원성이 변화되기도 한다. 특히, 조직 표본제작과정에서 문제가 되는 것은 고정액이나 유기용매의 작용 및 온도에 의한 영향이다. 고정액의 작용에 의해 실활된 항원활성은 모두가 반드시 비가역적인 것은 아니고, 다만 항원결정기가 가려진 상태에 지나지 않는다고 생각되는 경우도 있다. 예를 들어 10% formalin에 의해 immunoglobulin의 면역염색성이 저하되는 것은, 그 항원결정기의 아미노기가 포르말린의 알데히드기와 반응하여 가교를 형성하기 때문인 것으로 보고 있어서, 그 가교를 가르는 방법으로써 각종 단백분해효소를 작용시키거나 microwave oven, autoclave, steamer 등 antigen retrieval system을 이용하여 항원을 검출하는데 좋은 성적을 얻고 있다.

  9. 항체(Antibody) 면역글로브린 면역글로부린은 혈청, 림프액, 각 부위의 분비액 등에 함유되어 있으면서 항체활성을 갖고 있는 당단백질(glycoprotein)로, 그 항원구조와 역할에 따라 IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE등의 5종류로 구별되며 그 중에 면역조직화학에 이용되는 항체는 IgG분자이며 이를 이용하는 이유는 혈청에서 주된것이 IgG(전 면역글로부린중 70~80%, 혈중농도: 1200~100mg/dl)이고 분자량(150,000) 역시 가장 적기 때문이다. IgG분자는 아미노산이 여러 개의 연결된 단백질로 Y자형의 구조를 하고 있다. IgG는 항원과의 결합부위를 갖는 Fab(antigen binding fragment)라 불리는 두 개의 손과 Fc(crystallizabl fragment)라 불리는 결정화하기 쉬운 부분으로 구성되어 있으며 중심에는 경첩 구실을 하는 hinge라 불리는 부분이 있다. IgG분자 구조를 좀 더 상세히 살펴보면 4개의 아미노산사슬(2개의 긴사슬과 2개의 짧은 사슬)이 항원자끼리의 결합(S-S결합)에 의해 연결되어 하나의 분자를 형성하고 있다. 긴 사슬 하나는 아미노산이 446개, 짧은 사슬은 214개의 아미노산으로 구성되는데 긴 사슬끼리 및 짧은 사슬끼리는 아미노산 배열수서가 동일하므로 분자의 중심선에 대해 좌우대칭의 구조를 하고 있다. 따라서 하나의 IgG분자에는 동일한 항원과 결합 할 수 있는 결합손이 2개씩 존재하며 면역조직화학에서는 IgG분자의 이런 구조적 특성을 검사에 이용하는 경우도 있다. 또한 Fc부분은 동물의 종(species)에 따라 모두 동일한 점도 검사과정에 이용하기도 한다.

  10. 항혈청(Antiserum) 항혈청이란 특정의 항원과 반응하는 항체를 함유한 혈청 항혈청의 전제 조건은 역가(titer)- 항혈청 중에 포함되어 있는 특이 항체활성을 가진 면역글로부린의 농도 특이성(specificity)- 항혈청 또는 항체글로불린이 어떻게 어느 특정 항원물질을 선택적으로 인식하여 반응하는 것. 친화성(affinity)-친화성은 항혈청에 포함된 항체가 항원과의 결합하는 강도 이 세가지 전제 조건이 충족되지 않으면 면역염색에서 만족스러운 결과를 얻기가 힘들다.

  11. 다클론 항체와 단클론 항체 면역조직화학에서 이용되는 1차항체는 크게 다클론 항체와 단클론 항체로 구분한다. 항원에는 항체와 결합하는 항원결정기가 분자량 5,000마다 하나 정도 존재하므로 항원의 분자량이 크면 하나의 항원에 존재하는 모든 항원 결정기에 대응하는 여러 종류의 항체가 형성되게 된다. 이와같이 '하나의 항원분자에 존재하는 다수의 항원결정기에만 결합할 수 있는 여러 종류의 항체가 혼합된 항혈청'을 다클론 항체라 한다. 그러나 하나의 항체생성 만들어지는 항체는 하나의 항원결정기에만 결합할 수 있으므로 하나의 항체생성세포를 분리하여 myeloma세포와 융합시킨 잡종세포로부터 얻는 항혈에는 '하나의 항원결정체에만 결합할 수 있는 한 종류의 항체'만 존재하는데 이런 것을 단클론 항체라 한다.

  12. 4.4. 항원과 항체 일반적으로 항체란 바이러스나 세균과 같이 인체에 유해한 물질의 자극에 의해서만 형성된다고 생각하기 쉬우나, 면역이란 자기자신과 자기자신이 아닌 것을 구분하는 것을 기본으로 하기 때문에 혈액순환을 하는 모든 생물을 자신(개체)을 구성하고 있는 물질이 아닌 이질체(foreign body)가 주입되면 이를 구분하고 이질체를 제거하기 위한 반응을 나타낸다. 이런 방어반응 가운데 하나가 항체(antibody)의 생성이다. 따라서 사람의 어떤 세포성분(X)을 순수하게 정제하여 생쥐나 토끼등에 주입하면 X에 대한 항체 즉, an

  13. 표지법 항체 및 항원을 표지물질로 표지하여서 면역반응을 이용하여 염색하는 방법으로 전자를 표지항체법, 후자를 표지항원법이라 부르고 있다. 1.표지항체법 형광항체법과 효소항체법의 2종류가 있다. 양자 모두 반응방법에 따라 직접법과 간접법이 있다. 두 방법중 감도가 높고 1차항체를 표지하지 않은 간접법이 주로 이용되고 있다. 2.표지항원법 항체 대신 항원물질을 표지하여 표본내에 존재하는 항체를 검출하는 방법

  14. 비표지항체법 효소항체법의 감도를 좌우하는 조건의 하나는 항체와 표지효소(peroxidase)의 결합비율이다. 항체나 효소는 일반적으로 화학적 결합방법이 이용되며, 항체1분자에 효소1분자가 결합되나 100%의 항체를 표지시키는 것이 매우 어렵다. 그러므로 항원-항체 반응물에 다수의 효소를 효율적으로 결합시키는 PAP법·ABC법·APAAP법과 Protein-A법 등이 개발된 것이다. 이 방법들은 모두 1차·2차항체를 직접 표지하지 않고 면역염색을 하기 때문에 비표지법이라고 불리고 있다.

  15. PAP법(peroxidase-antiperoxidase method) PAP법은 항원 X에 특이성을 가진 1차 항체를 반응시킨 후 1차 항체와 PAP항체를 연결시켜주는 2차 항체(link antibody)를 반응시키고 이어서 PAP항체를 반응시키고 마지막으로 발색단계를 거치는 4단계로 진행되는 염색법이다. 여기서 1차 항체와 PAP항체(peroxidase의 항원성을 이용, anti-peroxidase를 제작하여 가용성의 peroxidase complex 즉 PAP항체를 만든다)는 동일한 동물에서 항체를 제조한 것이므로 두 항체의 Fc부분이 동일하다. 이 Fc부분이 동일한 점을 이용하여 1차 항체와 PAP항체의 Fc부분에 특이성을 나타내는 항체를 제3의 동물에서 제조하여 1차 항체와 PAP항체의 Fc부분을 연결시키는 방법이다.

  16. ABC법(avidin-biotin-peroxidase complex method) ABC법은 당단백질인 "avidin"이 저분자량 비타민인 "biotin"에 친화력이 매우 강한 것을 이용하는 방법이다. Avidin(분자량 68,000)은 계란 흰자위에 존재하는 당단백질(glycoprotein)로 4개의 biotin과 결합할 수 있는 입체구조를 하고 있다. biotin(vitamin-H, 분자량244.3)은 쉽게 항체의 Fc부분에 접착시킬 수 있으므로 2차 항체에 부착시켜서 사용하고 있다(biotinylated link antibody). Biotin분자 150개 이상이 항체분자 하나에 부착될 수 있으므로 ABC법은 PAP법에 의해 1차 항체는 4배 정도 희석할 수 있고 2차 항체는 수백배 희석하여 사용할 수 있는 민감도가 높은 방법으로 현재 가장 많이 사용되고 있는 방법이다. 그러나 ABC법에 사용되는 Avidin에는 oligosaccharide잔기가 존재하여 이 잔기의 하전특성에 의해 조직성분에 약간의 친화력을 나타내므로 비특이적인 결합을 할 수 있는 단점이 있다. Streptomyces avidinii라는 세균의 배양액으로부터 추출되는 Streptoavidin(분자량 60,000)이라는 물질은 avidin과 유사한 특성을 갖고 있으면서 Oligosaccharide잔기가 없기 때문에 avidin의 결점을 보완 할 수 있다.

  17. APAAP법(alkaline phosphatase – antialkaline phosphatase method) HRP 효소 대신 alkaline phosphatase(ALP)를 항체에 표지하여 행하는 방법으로 PAP법과 같이 전체 반응을 항원-항체반응만으로 행한다. Protein-A법 Protein-A법은 황색포도상구균의 단백성분인 Protein-A가 포유동물의 IgG의 Fc부분과 특이적으로 결합하는 성질을 이용하는 방법

  18. 검체의 고정 및 전처리 고정 (Fixation) 고정은 면역 반응성의 보존에 직접적인 영향을 미친다. 또한 사용하는 고정액의 종류와 고정시간에 따라 항원 결정부위의 보존에 미치는 영향이 달라진다. 면역조직화학적 연구를 위한 이상적인 고정액은 다음과 같다. 첫째 항원의 면역 반응성을 파괴하지 않아야 한다. 둘째 세포형태를 잘 보존해야 한다. 셋째 고정으로 항원의 위치가 확산되거나, 유실되는 것을 방지해야 한다. 넷째 항원-항체 반응을 방해해서는 안된다.

  19. Blood smears와 Cytology smears : 95% Ethyl Alcohol 100% Acetone Acetone : Methanol (1:1) Cryostat sections : Acetone (-20℃) 95% Ethyl Alcohol Paraffin embedded sections : Formaldedhyde-based fixatives : - Neutral buffered formalin solution(NBF) - Bouin's solution Mercuric chloride-based fixatives : - B5 solution - Zenker's solution - Acetic acid-Zinc chloride - Periodate-Lysine-Paraformaldehyde (PLP)

  20. 항원성의 부활 (Antigen retrieval) Paraffin embedded sections을 이용한 면역조직화학적 염색을 하는 경우 trypsin, pepsin, protease와 같은 단백질 분해효소나 Citrate buffer, EDTA buffer등을 이용한 가열처리로 전처리함으로써 조직절편내의 항원성이 활성화 된다. 이 항원성의 소실은 포름알데히드 고정액에 의해 항원성이 차단되기 때문이다. 그 이유의 하나는 유리아미노기의 소실에 기초한 항원 결정기의 변성에 의한 것이지만, 두 번째 이유로는 항원결정기를 포함한 단백질분자내에 가교(crosslinking)내지 주변 단백질분자와의 사이에 가교에 기초한 입체구조의 가역적인 변형에 있다. 후자의 경우는 가교에 의해 형성된 입체구조의 변형 때문에 항체분자가 항원결정기와 반응하지 못한다. 따라서 이 입체구조의 장해를 제거하기 위해 단백질분해효소나 antigen retrieval buffer를 이용한 가열처리를 하는 것이다.

  21. Proteolytic enzyme digestion ① Trypsin digestion ② Protease digestion ③ Proteinase-K & Pepsin digestion Heating Method ① Antigen retrieval buffer ② Heat source Microwave oven Steamer Autoclave pressure cooker Waterbath

  22. Immunohistochemical examinatin에서의 Pretreatment 방법 1. Autoclave 2. Microwave oven 3. 1+2의 기기

  23. 내인성 효소활성 (Endogenous enzyme activities) 면역염색을 시행하는데 있어서 표지제로 사용하려는 효소와 동일하거나 유사한 효소가 조직내에 존재한다면 위양성반응을 나타낼 수 있으므로 1항체를 반응시키기 전에 이런 효소의 활성을 억제시켜야 한다.

  24. 내인성 peroxidase활성의 억제 백혈구, 적혈구,간세포를 비롯한 정상세포나 종양 세포에는 peroxidase와 pseudoperoxidase반응을 나타내는 물질이 존재한다. 이런 효소의 활성을 억제하는 방법으로는 0.3% H2O2 in D/W 0.3% H2O2 in Methanol 5mM periodic acid 0.1% phenylhydrazine in PBS 등이 있다.

  25. 내인성 alkaline phosphatase활성의 억제 Alkaline phosphatase(ALP)의 동위효소(isoenzme)는 사람의 조직내에 널리 분포되어 있다. 특히 소장점막이나 신장의 근위요세관 흡수세포에서 고농도로 존재한다. 또 ALP는 뼈조직의 칼슘침착에서 중요한 역할을 하는 골모세포에도 존재한다. 이 밖에 림프절, 비장, 편도나 동맥 또는 모세혈관내피 및 세포의 표면, 간질세망세포 호중구 내에서도 검출된다. 이런 ALP의 활성을 억제하는 방법으로는 1mM levamisole 20% acetic acid 0.3% hydrogen peroxide 2.5% periodic acid 등이 있다.

  26. 기질과 발색소(Substrates and Chromogens) Horseradish peroxidase (HRP) 표지제로 peroxidase를 사용하는 경우 보통발색제로 DAB(3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride)와 AEC(3-amino-9-ethylcarbazole)를 가장 많이 사용한다. 발색액에 기질로 과산화수소(hydrogen peroxide)와 발색제를 혼합하여 반응시키면 peroxidase가 과산화수소를 분해하면서 형성된 O₂가 발색제를 불용성의 유색침전물로 형성하면서 발색되는 원리를 이용하고 있다. DAB를 발색제로 사용하는 경우에는 결과가 갈색으로 나타나며 alcohol에 불용성이므로 탈수투명과정을 거쳐 지용성 봉입제로 봉입할 수 있다. 이에 반해 AEC는 결과가 적색이며 alcohol에 용해되기 때문에 수용성 봉입제를 사용해야한다. 두 가지 모두 발암물질(carcinogen)이므로 취급에 세심한 주의가 필요하다. 기타 chromogen으로는 4-Chloro-1-naphthol (CN), p-Phenylenediamine dihydrochloride등이 있다.

  27. Calf intestine Alkaline Phosphatase(AP) 표지제로 alkaline phosphatase인 경우에는 효소가 기질인 naphthol phosphate를 분해하여 naphthol을 azo dye로 치환시키는 발색 방법을 이용하므로 발색제로 Fast red TR이나 hexazotized new fuchsin을 사용하며, 결과는 모두 적색으로 나타난다. Fast red TR대신 Fast blue BB를 대신 사용할 수 있으며 결과는 청색으로 나타난다. Fast red TR은 alcohol에 용해되기 때문에 수용성 봉입제로 봉입해야 하지만, new fuchsin은 신속한 탈수과정을 거쳐 지용성 봉입제로 봉입할 수 있다.

  28. 항원-항체의 비특이적 결합방지 면역염색에 있어서 특이적이든 비특이적이든 back ground stain이 될 수 있다. 특이적인 배경염색은 판독에 큰 문제가 없으나 비특이적인 반응은 결과를 오판할 수 있으므로 미리 비특이적인 배경염색을 최소화해야 한다. 비특이적으로 배경이 염색되는 중요한 원인은 조직절편 내의 소수성(hydrophobic)과 정전기적 힘에 의해 항체가 비면역학적인 결합을 하기 때문이다. 이런 것을 방지하기 위해서 보통 2차항체를 제조한 동물종과 동일한 동물종의 정상혈청(normal whole serum, cheap source of IgG)을 절편에 반응시켜 1차항체와 비특이적으로 반응할 부위와 결합시키므로, 1차항체와 비특이적인 반응을 일으키는 현상을 차단시킬 수 있다. 이런 목적으로 사용되는 혈청을 '차단혈청(blocking serum)'이라고 한다. 사용하는 1차항체의 순도가 낮아 목적하는 항체 이외에 여러 가지 항체가 포함된 경우에도 비특이적인 결과를 나타낼 수 있다. 이런 경우에는 1차항체의 희석배율을 높게 하면 비특이적인 결과를 어느 정도 줄일 수 있다.

  29. 면역염색 방법 형광항체법 효소항체법 1 PAP법 2 ABC법과 LSAB법 3 Rapid staining protocol (Frozen sections)

  30. 형광항체법 형광항체법은 면역조직화학적 염색법 중 가장 초기에 확립된 방법으로 쿤스(Coons, A.H.1950) 등의 발표 이후 30년 이상 철저한 개량 과정을 거쳐 오늘날에는 고도로 세련된 신뢰성이 높은 기법으로 발전되었다. 형광항체법에서 항체의 표지에 사용하는 형광염료(fluorochome)은 여러 종류가 있다. 이 중 가장 사용빈도가 많은 염료는 fluorescein isothiocyanate(FITC)와 tetramethylrhodamine isoehiocyanate(RITC, 약칭 rhodamine)의 2종류이다. 전자는 분자량 389, 최대흡수파장490 nm, 최강 형광파장(표지항체로서 사용시) 525nm를 나타내며 그 형광은 녹색을 띤다. 또 후자는 분자량 443, 최대흡수파장 550nm, 최강형광파장 620nm이며 그형광은 적등색을 나타낸다. 형광항체법은 크게 나누어 형광염료가 표지된 항체를 조직절편과 직접 반응시켜서 항원 부위를 검출하는 방법(직접법)과 항원 부위에 대응하는 항체 또는 항혈청(2차항체)을 반응 시키는 방법(간접법)이 있다. 최근에는 protein A가 대부분의 IgG와 특이적으로 반응하는 것을 이용하여 FITC labelled-protein A를 2차 항체로 이용하는 방법도 개발되어있다. 이 protein A법은 시료중에 존재하는 IgG가 반응하여 위양성을 나타내는 점만 주의하면 감도가 좋은 방법이다. 형광항체법은 항체의 표지에 사용한 염료의 형광이 퇴색하기 쉽기 때문에 표본은 최대 2-4주간 보존할 수 밖에 없어 영구표본을 얻기가 불가능하며, 암시야에서 관찰하므로 조직세포구조의 식별이 곤란하여 항원의 국재를 정확히 파악하기 곤란한 단점이 있으나 특이성이 높고, 감도가 좋으며, 염색의 콘트라스트가 양호하여 미소항원의 검출에 적합하다는 장점이 있기 때문에 널리 활용되고 있다. 현재 삼성서울병원에서는 형광항체법을 이용하여 검사를 시행하는 검체는 주로 피부나 신장의 생검조직이다.

  31. Primary Antibody : IgG (Fc piece specific) ; DiaSorin,82907 IgA (α chain specific) ; DiaSorin,82905 IgM (μ chain specific) ; DiaSorin,82909 C1q Fluorescent conjugate ; DiaSorin,82920 C3 Complement (β1C/β1A) ; DiaSorin,82901 C4 Complement (β1E) ; DiaSorin,82902 Fibrinogen Fluorescent conjugate ; DiaSorin,82903 Albumin Fluorescent conjugate ; DiaSorin,82900 ( 상기 Ab는 1:40으로 희석하고 -4℃, 1500 rpm 5분간 원심분리 후 사용한다.) 위와 같이 형광염색을 시행한 후에는 형광소퇴를 방지하기 위해 냉장 보관 신속하게 관찰하고 사진 촬영을 하는 것이 좋을 것이다. 형광상의 기록은 사진촬영에 의한 방법과 CCD등에 의한 디지털화상이 있으나, 어떤 방법을 사용하더라도 적절한 필터(dichroic mirror)의 선택과 올바르게 현미경을 설정 가능한 신속히 형광상을 기록.

  32. I.F 검체의 절편제작

  33. Direct Immunofluorescence method 1. Cut frozen section (-20℃,5㎛) 2. Dry sections for 30min 3. Tissue is fixed in aceton (1min, -20℃) 4. Dry sections for 10min 5. Wash with PBS (3×3min) 6. Incubation with FITC or RITC coniugated primary antibody (dark room,25℃,1hrs) 7. Wash with PBS (3×3min) 8. Coverslip (Universal mount) Regeants Washing buffer : 0.01M Phosphate buffered saline (pH7.0) Sod. Chloride 80g Pot. Chloride 2g Sod. Phosphate monobasic 2g Sod. Phosphate dibasic 11.5g D.W 10 liter Mounting solution : Universal Mount(Research Genetics,750105)

  34. 효소항체법 조직과 세포 안에 분포하는 소량의 항원 단백을 가시화하려고 할 경우, 또는 포르말린 고정이나 파라핀 포매 처리로 항원성이 현저히 저하된 항원물질을 증명하려는 경우에 항원항체반응, 효소기질 및 효소반응의 단계를 다양하게 연구함으로써 감도를 크게 증폭시키는 방법이 개발되어 왔다. 반응의 재현성, 순서의 간략화를 위해 여러 종류의 방법이 개발되었고 여러 종류의 kit가 상품화되어 누구라도 쉽게 염색할 수 있도록 되어 있으나, 항체의 성질, 조직내 항원의 성상, 염색결과의 판정등에 세심한 주의를 하지않으면 정확한 항원부위를 확인하기가 어렵다.

  35. PAP법 PAP법은 Sternbuerger등에 의해 1970년에 개발된 방법으로 HRP을 효소에 직접 표지하는 대신에 항원항체반응에만 의존한 점이 특징이라고 할 수 있다. 우선 일차항체(예를 들면 토끼 항X항체)에 이어 비표지 이차항체(예를 들면 돼지 항 토끼IgG항체)과잉량으로 반응시킨다. 다음으로 미리 in vitro에서 제작해둔 HRP와 토끼 항 HRP항체의 강요성 항원항체복합물(soluble immunue complex), 즉 PAP를 반응시킨다. 이차하체가 과잉량으로 존재할 때에 이론적으로는 이가(bivalent)인 IgG의 항원결합부 2개 중에서 하나는 자유롭게 남아 있다. 남아 있는 한쪽 IgG "팔 부분"에 PAP complex가 결합된다.

  36. PAP Procedure ⓐ Incubate tissue 5minutes with peroxidase blocking reagent ⓑ Rinse with and place 3~5min in TBS ⓒ Incubate 5minutes with a protein-blocking regent to reduce background. ⓓ Tap off excess protein blcok. Incubate 20min. DO NOT RINSE ⓔ Primary antibody. Incubate 30min ⓕ Rinse with and place 3~5min in TBS ⓖ Swine anti-rabbit or Rabbit anti-mouse Ab. Incubate 30min ⓗ Rinse with and place 3~5min in TBS ⓘ horseradish peroxidase-rabbit(-mouse) anti -peroxidase(PAP) complex. Incubate 30min ⓙ Rinse with and place 3~5min in TBS ⓚ Incubate 5minutes with peroxidase substrate chromogen solution. ⓛ Rinse gently with distilled water from wash bottle. Counterstain and coverslip

  37. ABC법과 LSAB법 달걀 흰자위의 염기성 단백질인 avidin과 미타민의 일종인 biotin 사이에 대단히 공고하게, 그리고 특이적인 결합이 형성되는 것을 조직화학 분야에 처음으로 도입한 연구자들은 Heitzmann과 Richards로, 그들은 biotin화 세포막을 avidin화 ferritin을 이용하여 전자현미경으로 관찰하였다. Heggeness와 Ash는 biotin화 heavy meromyosin과 actin과의 반응 및 biotin화 항myosin항체와 myosin과의 반응을 형광색소표지 avidin을 이용하여 관찰하였다. Guesdon등은 avidin과 biotin의 결합반응을 HRP에 의한 면역조직화학에 이용하여, 다음에 소개하는 bridged avidin biotin(BRAB)법과 labeled avidin biotin (LAB)법을 개발하였다. 현재는 ABC법(avidin-biotinylated peroxidase complex method)과 LAB법이 자주 사용되나, 근래에는 avidin 대신 streptavidin이 이용된다. 이 경우 각각 SABC법, LSAB법이라 부른다.

  38. ABC Procedure ⓐ Incubate tissue 5minutes with peroxidase blocking reagent ⓑ Rinse with and place 3~5min in TBS ⓒ Incubate 5minutes with a protein-blocking regent to reduce background. ⓓ Tap off excess protein blcok. Incubate 20min. DO NOT RINSE ⓔ Primary antibody. Incubate 30min ⓕ Rinse with and place 3~5min in TBS ⓖ Biotinylated secondary antibody. Incubate 30 min. ⓗ Rinse with and place 3~5min in TBS ⓘ (Strept)avidin-biotin complex. Incubate 30 min ⓙ Rinse with and place 3~5min in TBS ⓚ Incubate with substrate until desired staining intensity has developed ⓛ Rinse gently with distilled water from wash bottle. Counterstain and coverslip

  39. LSAB Procedure ⓐ Incubate tissue 5minutes with peroxidase blocking reagent ⓑ Rinse with and place 3~5min in TBS ⓒ Incubate 5minutes with a protein-blocking regent to reduce background. ⓓ Tap off excess protein blcok. Incubate 20min. DO NOT RINSE ⓔ Primary antibody. Incubate 30min ⓕ Rinse with and place 3~5min in TBS ⓖ Biotinylated link antibody. Incubate 30 min. ⓗ Rinse with and place 3~5min in TBS ⓘ Streptavidin-HRP. Incubate 30 min ⓙ Rinse with and place 3~5min in TBS ⓚ Substrate-chromogen solution. ⓛ Rinse gently with distilled water from wash bottle. Counterstain and coverslip

  40. Rapid staining protocol (Frozen sections) 이 방법은 Frozen section으로 빠른 진단을 요할 때 사용하는 방법이다. 삼성서울병원 병리과에서는 일반외과와 함께 환자에게 보다 정확한 진단과 양질의 서비스를 제공하기 위하여 이 검사법을 도입하였는데, 이것은 Sentinel lymph nod에 전이 여부를 알기위해서 시행한다. 종목은 현재 Cytokeratin을 시행하고 있다.

  41. Rapid staining protocol (Frozen sections) ⓐ Fixation of frozen section (-20℃,Acetone). 30sec ⓑ Rinse with TBS ⓒ Incubation with the primary antibody(Cytokeratin, 1:20). 3min 10sec(37℃) ⓓ Rinse with TBS ⓔ Labelled Ploymer-HRP Anti-Rabbit/Mouse. 3min 10sec(37℃) ⓕ Rinse with TBS ⓖ Incubation with the substrate solution. 3min 10sec(37℃) ⓗ Counterstaining and mountiong

  42. Immunological Examination * Immunohistochem. * I.F Autoimmunostainer Immunofluorescence CD series

  43. 자동면역염색기의 염색원리 * 모세관형상방식 염색 용기와 유리 슬라이드를 서로 마주보게 하든지, 전용 유리 슬라이드를 서로 마주보게 해서 약간의 틈을 만들어 거기에 반응액(항체, 완충액 등)이 흡착되도록 하여 조직절편과 반응시킨다. * 분무(스프레이)식 유리 슬라이드 위에 직접 뿌려 반응시킨다. *떨어뜨리는(적하)방식 수평으로 설치한 유리 슬라이드 위에 반응액을 한 방울씩 떨어뜨려 반응시킨다. 염색방법은 모든 염색장치에서 LSAB법을 이용하고 있다. 자동면역염색기의 부가적 기능 대부분의 자동명역염색장치는 발색 및 핵염색의 염색조작이 가능하다. 부가적 기능으로 베이킹(절편 건조, 파라핀 용해), 탈파라핀, 가열에 의한 항원성 부활화 처리를 가능하게 한 기기도 있다. 최근 기종에는 얇게 자른 절편을 그대로 장치에 설치하는 것만으로 절편 건조, 탈파라핀, 면역염색, 발색,핵염색까지 모든 것을 자동화하고 있다. 또한 면역염색 이외에도 색소를 사용하는 특수염색, in situ hybridization법이 가능한 기종도 있어서 범용성이 높아 더욱 기능이 다양해지고 있다.

  44. AutoImmunoStainer Techmate -1000

  45. Antibody, Ab dilution 및 기타 면역 시약

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