Genetiske undersøgelse ved hæmostaseforstyrrelser

1. Genetiske undersøgelse ved hæmostaseforstyrrelser Ved Peter Böhm Nielsen Klinisk Biokemisk Afdeling, Rigshospitalet

2. Genomet som legeplads Det humane genom: ca. 3.3 milliarder basepar Ensemble database – september 2011

3. Det centrale dogme

4. Genetic Variation in an Individual Human Exome Craig Venter (1) • Fokus var på en persons ”exom”, fordi det menes at favne en stor del af den funktionelle variation. • Der blev identificeret 10.400 nonsynonyme single nukleotid polymorfier (nsSNPs) i Craig venter, hvoraf, 15-20% var sjældne i forhold til referencesekvensen. De forudså at 1.500 nsSNPs ville påvirke proteinernes funktion og af disse fandtes hovedsageligt heterozygote og sjældne. Af de 700 fundne indels havde halvdelen tripletslængder i forskellige mængder, hvilket indsætter eller fjerner aminosyrer i det tilsvarende protein frem for at indføre frameshifts. Pauline C. Ng*, Samuel Levy, Jiaqi Huang, Timothy B. Stockwell, Brian P. Walenz, Kelvin Li, Nelson Axelrod, Dana A. Busam, Robert L. Strausberg, J. Craig Venter, PLoS Genetics, 2008

5. Genetic Variation in an Individual Human Exome Craig Venter (2) Pauline C. Ng*, Samuel Levy, Jiaqi Huang, Timothy B. Stockwell, Brian P. Walenz, Kelvin Li, Nelson Axelrod, Dana A. Busam, Robert L. Strausberg, J. Craig Venter, PLoS Genetics, 2008

6. August 2007 Maj 2009 Beskrevne DNA varianter (1)

7. August 2010 September 2011 Beskrevne DNA varianter (2)

8. Analyseopsætning – PCR (1)

9. Analyseopsætning – PCR (2)Vurdering af kendte varianter

10. Analyseopsætning – PCR (3)Pseudogener (1) Primer med 3’-ende ved variant eller skæring med restriktionsenzym.

11. Analyseopsætning – PCR (4)Pseudogener (2) Allel 1 VWF Allel 2 VWF Allel 1 VWFP Allel 2 VWFP Fortynding af VWF-gen med pseudogen

12. Analyseopsætning – PCR (4) M13-haler PCR produkt 1 PCR produkt 2 M13 haler indkorporeres i PCR produkterne, så kun en forward og en reverse primer skal benyttes. Smart ved store gener. M13 Forward (-20)                        GTAAAACGACGGCCAGTGM13 Forward (-41)                        GGTTTTCCCAGTCACGACM13 Reverse (-27)                        GGAAACAGCTATGACCATGM13 Reverse (-48)                        AGCGGATAACAATTTCACACpYESTrp Forward                        GATGTTAACGATACCAGCCpYESTrp Reverse                        GCGTGAATGTAAGCGTGAC

13. Analyseflow (sekventering)

14. Missense, nonsense og silent mutation - sekvens udseende Reference: Eksempel på polymorfi. Varianten er hyppig i befolkningen.   Patient: Eksempel på punktmutation (sort pil), hvor en base skiftes med en anden.

15. Deletion / addition- sekvens udseende Reference. Patient: Eksempel på deletion, hvor en base er fjernet. Sekvensmønsteret ændrer karakter er bliver overvejende et ”heterozygot” mønster.

16. Case 1 (1) Ung pige får taget status-blodprøver i forbindelse med ambulatoriebesøg med henvisning fra praktiserende læge.

17. Case 1 (2)F7 exon 8 Arg277His

18. Case 1 (3)Klinik - artikelsøgning • Arg277His varianten er placeret i et område i proteinet, der har katalytisk aktivitet samt interagerer med tissue faktor (TF). • Det er vist at reagenser, der bruger thromboplastin fra forskellige arter kan have effekt på aktiviteten af FVII. • KFII+VII+X analysen bruger thromboplastin fra kaninhjerne og enkelt KF7 fra human placenta. • KF7’s affinitet til human thromboplastin er normal, hvorimod affiniteten til kaninhjerne er lavere, hvorfor KFII+VII+X analysen er udenfor referenceintervallet. • Konklusion: Patienten har ikke ændret blødningstendens.

19. Case 2 (1) Ung pige skal have lavet en thrombofiliudredning, så der tages en række blodprøver. Blandt andet antithrombin.

20. Case 2 (2)AT3 exon 2 Arg47His

21. Case 2 (3)Klinik - artikelsøgning • Arg47His varianten er en velkendt mutation, der giver antithrombin mangel type IIb, hvor bindingen til heparin er afficeret. • Konklusion: Genetisk variant i Serpinc1-genet, der resulterer i at thrombin ikke hæmmes hensigtsmæssigt. Lysine 114 of antithrombin is of crucial importance for the affinity and kinetics of heparin pentasaccharide binding. Veronique Arocas et at 2001

22. Analyseflow (Taqman)

23. FRET FRET FRET Match Mismatch FRET Taqman-assay F2 & FV-Leiden (1)

24. VIC FAM FRET FRET A G T C Taqman-assay F2 & FV-Leiden (2) SNP: G  A

25. Taqman – resultatvalidering

26. FV-Leiden undersøgelse (1) Position 1q23 FV-genet, 2224 aminosyrer FV-Leiden Arg506Gln Aktiveret protein C (APC) inaktiverer FV ved kløvning flere steder i proteinet, hvilket hæmmer clot-processen. APC kløver blandt andet ved Arg506.

27. FV-Leiden undersøgelse (2) • FV-Leiden varianten er den hyppigste arvelige årsag til thrombofili. • Arvelig thrombofili-sygdom, hvor personer med FV-Leiden varianten har større risiko for dyb venøs thrombose. • Ca. 10% af personerne med FV-Leiden varianten oplever abnorm clot-dannelse. • Mellem 3-8% af personer med Kaukasisk afstamning er heterozygote for varianten & 1:5000 er homozygote. • Har personer samtidig en anden variant i FV-genet er risikoen yderligere forøget. • Risiko for abnorm clot-dannelse er for heterozygote 3-8:1000 & for homozygote 80:1000, når den generelle befolkning har 1:1000 risiko.

28. FV-Leiden undersøgelse (3)

29. F2 – prothrombin undersøgelse (1) Position 11p11 F2-genet, 622 aminosyrer F2-prothrombin 20210 G>A F2 prothrombin aktiveres via FV og FX til thrombin. Varianten giver et overaktivt F2-gen, der producerer for meget prothrombin. Den for høje mængde prothrombin resulterer i for høj mængde thrombin ved aktivering af koagulationssystemet.

30. F2 – prothrombin undersøgelse (2) • Prothrombin varianten er den næst hyppigste arvelige årsag til thrombofili. • Arvelig thrombofili-sygdom, hvor personer med prothrombin varianten har større risiko for dyb venøs thrombose. • Ca. 10% af personerne med FV-Leiden varianten oplever abnorm clot-dannelse. • 2-3% af personer med Kaukasisk afstamning er heterozygote for varianten & 1:5500 er homozygote. • Har personer samtidig en variant i at andet koagulationsgen og dermed protein produkt er risikoen yderligere forøget. • Risiko for abnorm clot-dannelse er for heterozygote 2-3:1000 & for homozygote 20:1000, når den generelle befolkning har 1:1000 risiko.

31. F2 – prothrombin undersøgelse (3)