Download
bs ts ph m h ng v n 1 n.
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
BS. TS. Phạm Hùng Vân (1) PowerPoint Presentation
Download Presentation
BS. TS. Phạm Hùng Vân (1)

BS. TS. Phạm Hùng Vân (1)

262 Views Download Presentation
Download Presentation

BS. TS. Phạm Hùng Vân (1)

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript

  1. Vai troø vaø yù nghóa cuûa caùc xeùt nghieäm sinh hoïc phaân töû trong chaån ñoaùn vaø theo doõi ñieàu trò beänh vieâm gan sieâu vi B vaø C BS. TS. Phạm Hùng Vân(1) • Giaûng vieân Boä Moân Vi Sinh, Khoa Y, ÑHYD TP. HCMChuû nhieäm toå Boä Moân Vi Sinh, Khoa ÑDKTYHPhoù phoøng thí nghieäm trung taâm ÑHYDThaønh vieân chính cuûa ANSORP vaø ARFIDCoá vaán khoa hoïc Coâng Ty NAM KHOA

  2. WHO 2001 Nhieãm vieâm gan sieâu vi B (HBV)

  3. HBsAg [+] PCR phát hiện HBV-DNA qPCR định lượng HBV-DNA HBVDNA [+] Phát hiện đột biến precore qHBVDNA 105 ALT ALT ALT Normal Biopsieor FibroscanAFP Điều trị qPCR định lượng HBV-DNA qHBVDNA/3th Bất thường 105 LamR, AdfR Phát hiện đột biến kháng thuốc Xét nghiệm sinh học phân tử cho viêm gan B

  4. Schering-Plough Nhieãm vieâm gan sieâu vi C (HCV)

  5. 85% (85) Mạn tính 15% (15) Khỏi 20% (17) Xơ gan 80% (68) Ổn định 25% (4.5) 75% (13) Ung thư ganXơ gan tiến triển Diễn tiến chậm Dieãn tieán nhieãm HCV Nhiễm HCV (100) (Phase cấp)

  6. Định lượngHCV genotype RT-qPCR ñònh löôïng HCV-RNA Ñònh genotype HCV Tuần 12 Định lượng RT-qPCR ñònh löôïng HCV-RNA >2 log10 hay âm tínhHCV-RNA <2 log10 Cân nhắc ngưng điều trị Genotype - 1 Điều trị 48 tuần Genotype non-1 Điều trị 24 tuần Cuối điều trị HCV-RNA RT-PCR phaùt hieän HCV-RNA Theo dõi sau 6 tháng HCV-RNA HCV RNA (+) Không đáp ứng HCV RNA (+) Tái phát HCV RNA (-) Đáp ứng Xét nghiệm sinh học phân tử cho viêm gan C (2002 NIH Consensus Conference)

  7. Thực tế đã đòi hỏi các nhà khoa học, đặc biệt là các nhà y học phải nhanh chóng phát triển và ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại, nhất là PCR và real-time PCR vào chẩn đoán và hổ trợ cho theo dõi điều trị bệnh nhân viêm gan siêu vi tại Việt Nam

  8. PCR và real-time PCR là một kỹ thuật hoàn toàn mở do vậy chúng ta có khả năng không phải bị lệ thuộc vào các hãng sản xuất kit ở nước ngoài, nhờ vậy giá thành sẽ rẽ

  9. DNA đích 4 1 1 Biến tính (94oC ) 2 2 Bắt cặp (55-65o C) 3 3’ 5’ 3’ 5’ 3 Kéo dài (72o C) n 2n Nguyên tắc PCR

  10. MồiTaq polymerasedNTPPCR buffer + MgCl2 DNA đích (Template) PCR MIX

  11. Phát hiện  qua kích thước (điện di)  hay qua trình tự (lai) 30X-40X 94oC/15s-1min 55-65oC/15s-1min 72oC/30s-3min

  12. Standard curve Ct curve Melt curve Real-time PCRchạy PCR và đồng thời phát hiện sản phẩm khuếch đại

  13. Camera Laser or UV Thiết bị Real-time PCR

  14. PrimersTaq polymerasedNTPPCR buffer + MgCl2 Chất phát huỳnh quang Target DNA (Template) Real-time PCR MIX Real-time PCR mix

  15. PCR có đặc hiệu không? Nuoâi caáy PCR PCR đặc hiệu tương đương nuôi cấy Ñònh danh döïa vaøo kieåu hình sinh vaät hoùa hoïc bieåu hieän töø caùc kieåu gen Xaùc ñònh döïa vaøo kích thöôùc ñoaïn gen hay moät trình töï ñaëc hieäu cuûa ñoaïn gen

  16. Các bước trong xét nghiệm PCR phát hiện tác nhân vi sinh vật Mẫu thử Chuẩn bị mẫu thử Tách chiết nucleic acid Chạy PCR Phát hiện sản phẩm PCR và phân tích kết quả

  17. Một xét nghiệm PCR định tính chuẩn mực

  18. Một xét nghiệm qPCR định lượng chuẩn mực

  19. Một xét nghiệm qPCR định lượng chuẩn mực

  20. Xác định Genotype HCV • Phương pháp real-time • Phương pháp InoLIPA • Phương pháp giải trình tự

  21. 5’NC HCV – cDNA HCV1 HCV2 Real-time TQ PCR Ethanol precipitation HCV3 PCR sequencing PCR product# 240bp Kết hợp định lượng và định genotype HCV (bằng giải trình tự)

  22. Xaùc ñònh genotype HCVso saùnh giaûi trình töï vaø InoLIPA (234 maãu)

  23. Định genotype HCV hữu dụng lâm sàngchỉ có phương pháp giải trình tự 5’-NC

  24. Phaân boá genotype HCVkeát quaû 918 maãu (21/9/2006-29/12/2007)

  25. Phát hiện đột biến kháng thuốc của HBV • Phương pháp PCR-RFLP • Phương pháp real-time • Phương pháp giải trình tự

  26. HBV – DNA 264F 827R Ethanol precipitation 95oC/5min94oC/30sec55oC/30sec72oC/1min72oC/10min PCR 40X PCR product# 550bp 567bp 827R PCR sequencing DTCS (Becman Coulter) CEQ 8000 Định genotype HBV và phát hiện đột biến kháng thuốcKỹ thuật giải trình tự vùng rt gene (Nam Khoa)

  27. Phát hiện kháng Lamivudine, adefovirgiải trình tựgene PreS Vừa phát hiện nhiều vị trí đột biến (kể cả heterozygote) Vừa cho kết quả genotype

  28. Xác định genotype HBV Tìm đột biến kháng thuốc của HBV BS nên cho chỉ định tìm đột biến kháng thuốc và genotype HBV khi bệnh nhân không đáp ứng điều trị lamuvidine

  29. Kết quả xác định genotype HBV Kết quả genotype của 455 mẫu huyết thanh bệnh nhân HBV-DNA [+]

  30. Tyû leä % ñoät bieán YMDD455 mẫu huyết thanh bn HBV-DNA [+]

  31. Ñoät bieán YMDD 455 mẫu huyết thanh bn HBV-DNA [+]Phaân bố theo lượng virus

  32. Promoter1762, 1764

  33. A B Kết quả PCR khuếch đại đoạn gen HBV precore dài khoảng 250 bp

  34. Kết quả Có 37 mẫu huyết thanh HBeAg (-) Đột biến precore Đột biến promoter

  35. “Knowing is not enough, we must apply Willing is not enough, we must do”Goethe Tri thức sẽ chẳng bao giờ đủNếu không đem trãi nghiệm với đời Ước vọng cũng trở thành vô nghĩaNếu cứ ngồi ôm mộng giữa chơi vơi Phan Kim Ngọc và Phạm Hùng Vân