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Lyse. # de virus. Latence. Rendement de lyse. Éclipse. Temps. Infection. Profil de Croissance Virale. Rendement de Lyse. Définition du rendement de lyse: N o de virus générés par une cellule infectée suite à un cycle infectieux complet Paramètres:

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    Presentation Transcript
    1. Lyse # de virus Latence Rendement de lyse Éclipse Temps Infection Profil de Croissance Virale

    2. Rendement de Lyse • Définition du rendement de lyse: • No de virus générés par une cellule infectée suite à un cycle infectieux complet • Paramètres: • La multiplicité d’infection (M.I.) est No de virus infectieux disponible par cellule • La M.I. sert aussi à déterminer le No de cellules infectées

    3. Multiplicité d’Infection Nombre de virus = 4 M.I. = 4/6 = 0.67 Ou 4 sur 6 cellules seront infectées Nombre de cellules = 6 • 3

    4. Multiplicité d’Infection Nombre de virus = 10 M.I. = 10/6 = 1.6 Ou 6 sur 6 cellules seront infectées Nombre de cellules = 6

    5. Calcul de la M.I. • 108 cellules sont exposées à 104 virus • Quelle est la multiplicité d’infection? • 104/108 = 10-4 Virus/cellule • Combien de cellules seront infectées? • 104 cellules seront infectées • Combien de cellules restent non-infectés? • 108-104 = approx. 108 cellules (et non 104)

    6. Calcul du Rendement de Lyse Nombre de virus produit =10 Ou 10 virus/4 cellules Donc rendement de lyse = 2.5 virus produits/cellule Nombre de cellules infectées = 4

    7. Calcul du Rendement de Lyse • M.I.=0.0001; # de cellules = 108 ; Après 10 heures il y a 106 virus • Quel est le rendement de lyse? • 0.0001 virus/cellule x 108 cellules = 104 virus ensuite le rendement de lyse est 106/104=100 virus/cellule • Quelle est la multiplicité d’infection après le premier cycle infectieux? • 100x plus de virus alors, la nouvelle MI est 0.0001 x 100 = 0.01.

    8. Calcul du Rendement de Lyse (suite) • Quelle est la multiplicité d’infection après le deuxième cycle infectieux? • 100x plus de virus alors, la nouvelle MI est 0.01 x 100 = 1 • Quelle est No de cycle infectieux total? • 3 cycles • Combien de virus sont produit à la fin du dernier cycle infectieux? • Rendement x nombre total de cellule = 100 x 108

    9. Énumération et Typage des Virus • Compte direct • Détermine nombre de virus totaux • Essai de plages • Détermine nombre de virus infectieux • Essai d’hémagglutination • Détermine nombre total de virus • Possible seulement avec les virus hémagglutinant • Qui possède l’hémmaglutinine – Ex. influenza • Infectieux et non infectieux • Essai d’inhibition d’hémagglutination • Typage antigénique de virus hémagglutinants

    10. Comptes Directs • Coloration négative • Microscopie électronique • Ne distingue pas particules infectieuses de non-infectieuses • Utile pour les virus qui ne peuvent pas être crus en laboratoire • Utilise des billes à une concentration connue pour estimer le volume du champ de vision 10

    11. Comptes Directs Viraux Observer au microscope Ajouter billes (104/mL) 10 billes dans un champ Donc un champ = 1µL 21 virus dans un champ Donc 21 virus/1µL = 2.1 X 104 virus/mL

    12. Essai de Plages • Infecter monocouches de cellules ou tapis bactériens avec différentes dilutions de virus • Déterminer le nombre de plages pour chaque dilution • Chaque plage est le résultat d’une seule cellule infectée par une seule particule virale • 1 UFP

    13. Les Plages • Effet cytopathique localisé • Lyse cellulaire • Chaque plage représente un foyer d’infection • Chaque foyer d’infection est initié par une cellule infectée

    14. 33 UFP/0.1ml d’une dilution de 10-4 Donc le titre de la suspension originale est: Préparation virale 9 mL milieu 9 mL milieu 9 mL milieu 9 mL milieu 9 mL milieu Facteur de dilution 3 330 33 3.3 X 106 UFP/mL

    15. Essai d’Hémagglutination • Mesure de la quantité minimale de virus requise pour agglutiner les globules rouges • 1 unité d’hémagglutination (UHA) Hémagglutination partielle Pas d’hémagglutination Hémagglutination complète ≥1UHA < 1UHA 0 UHA

    16. Essai d’Hémagglutination 1:8 1:8 Titre = 32 UHA 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 1:2 virus Dilution 8 8 16 16 32 32 64 64 128 128 256 256 Mélanger avec globules rouges Vu de côté Vu du haut

    17. Anticorps anti-virus présent Anticorps anti-virus absent Ac lie le virus Liaison du virus au GR inhibée Virus lient GR Hémagglutination inhibé Hémagglutination Essai d’Inhibition d’Hémagglutination

    18. Points importants à connaîtreCours_08 Nov 2013 • Les cellules sanguines • Connaître les noms • Leur origine • Les fonctions • Lieu d’action • Phagocytose (les différentes étapes) • Les deux cascades du complément (en détail) • Alterne • MB-Lectine(MBL) • Les sentiers communs et différents entre les 2 cascades • Comprendre comment les antigènes sont présentés aux Lymphocytes

    19. Cellules sanguines Macrophage Mastocyte Éosinophile Érythrocytes Moelle Basophile Os Monocyte Cellule souche hématopoïétique Mégacaryocyte Cellule myeloïde progénitrice Neutrophile Plaquettes Cellule progénitrice lymphoïde Lymphocyte T Cellule dendritique Cellule NK Lymphocyte B

    20. Cellules Polymorphonucléaires - Granulocytes • Cellules qui relâchent des granules • Enzymes digestives, antiseptiques et initiateurs de la réponse inflammatoire • Neutrophile • Cellule phagocytaire (cellules qui mangent) • Une concentration élevée indique d’une infection • Normalement ils restent dans système sanguin • Mais vont dans les tissus seulement s’il y a infection dans le tissu • Éosinophile • Phagocytaire pour les complexes antigènes/anticorps (étiquettes) • Combats les infections parasitiques • Impliqué dans les réactions allergiques • Basophile (dans le circulation)/Mastocyte (dans les tissus) • Initie et amplifie la réponse inflammatoire

    21. Cellules sanguines Macrophage Mastocyte Éosinophile Érythrocytes Moelle Basophile Os Monocyte Cellule souche hématopoïétique Mégacaryocyte Cellule myeloïde progénitrice Neutrophile Plaquettes Cellule progénitrice lymphoïde Lymphocyte T Cellule dendritique Cellule NK Lymphocyte B

    22. Leucocytes Non Granulaires • Monocyte/Macrophage/Cellule dendritique • Cellules phagocytaires • Relâchent les initiateurs de la réponse inflammatoire • Fait appel au système adaptatif (la 3ème ligne) • Cellules présentatrices d’antigènes (CPA) ou cellules professionnelles • Molécule présentatrice - CMHII • Cellules NK • Lymphocyte qui tue cellules infectées et tumorales

    23. Cellules sanguines Macrophage Mastocyte Éosinophile Érythrocytes Moelle Basophile Os Monocyte Cellule souche hématopoïétique Mégacaryocyte Cellule myeloïde progénitrice Neutrophile Plaquettes Cellule progénitrice lymphoïde Lymphocyte T Cellule dendritique Cellule NK Lymphocyte B

    24. Processus de la Phagocytose • Reconnaissance • PRR (TLR) – PMAP • Opsonines • Ingestion • Formation de phagosome • Fusion avec lysosome • Phagolysosome • Digestion/Destruction • Enzymatique & Chimique • Expulsion

    25. Phagocytose - Conséquences • Digestion enzymatique • Lysozyme, Lipases, Glycosidases, Protéases, Nucléases • Destruction oxydative par radicaux libres • Superoxidedismutase : 2O2- + H2O à H2O2 + O2. • Myéloperoxidase: Cl- + H2O2 à hypochlorite (javel) • Relâchement d’initiateurs de la réponse inflammatoire • Synthèse et sécrétion de cytokines • Présentation sur CMHII (CPA seulement)

    26. Cellules NK • Le CMHI est exprimé sur toutes les cellules sauf les neurones et les globules rouges • Tue cellules qui n’ont pas ou peu de CMHI • Cellules infectées par des virus • Cellules cancéreuses • Deux récepteurs de surface • Récepteur inhibiteur (dominant sur le récepteur activateur) • Interagit avec CMHI des cellules nucléées • Récepteur activateur • Interagis avec glycoprotéines induites par le stress

    27. CMHI Récepteur inhibiteur Cellule Cellule NK NK Récepteur activateur Protéine activatrice Cellule Infectée Cellule Infectée Action des Cellules NK Survie

    28. Cascades du Complément • La réponse innée comporte deux cascades • Alterne et MB-Lectine (MBL=Mannose Binding Ligand): • Implique une collection de protéines sériques (libre dans le serum et inactives) • Protéines du complément: • C1q, C1r, C1s, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8 et C9 • Protéines accessoires: B et P • Lectine qui lie le mannose qui se trouve seulement chez les bactérie (Voie MBL) • Protéases: MASP-1 et MASP-2 • Initié par la liaison à des composantes communes à une grande variété de bactéries: • Alterne: Liaison de C3b à lipide A, acide téchoïque • MBL: Liaison de MBL au mannose des capsules

    29. + C5a + C5b C5b C5 Bb Complexe CAM Ba C3 C3 C3b C3b C3b C3b C9 C9 C9 C9 C8 C9 C9 C9 C9 C9 Voie Alterne + H2O C3a C3a C3 Convertase C5 Convertase B P C6 C7 Bactérie Gram Négative • 29

    30. C5a C2 C2b C4 + C5b C5b MBL C5 C3b C3 C9 MASP2 C9 C9 C9 C8 C9 C9 C9 C9 C9 Voie de la MB-Lectine C4a C2a MASP2 MASP1 C4b C3a C4b C6 C7 C2a Capsule Bactérienne 30

    31. Conséquences des Voies du Complément • Opsonisation (étiquettes indiquant que les pathogènes doivent être détruits) • Liaison de C3b et C4b sur la bactérie • Bactéries, virus et parasites • Anaphylatoxines (des alarmes) • C3a et C5a • Activent granulocytes et monocytes • Relâchement d’initiateurs de la réponse inflammatoire • Dégranulation • Recrutement des autres cellules dans la région • CAM (pore) • Lyse osmotique • Bactéries Gram négatives – Permet lysozyme d’atteindre la paroi • Parasites – Perte de solutés

    32. Présentation & Activation • La présentation par les CPA est faite seulement aux lymphocytes Ta • Reconnaissance par les paratopes des RCT appropriés des lymphocytes Ta • Les CPA sécrètent des cytokines activatrices (substances solubles que agissent sur d’autres cellules) • Amplification clonale des Ta qui sont sélectionnées • Donc la réponse acquise est initiée!

    33. RCT TA CD4 Lymphocytes TA • Récepteur cellulaire – RCT • Reconnaissance d’épitopes non-soi présenté par le CMHII • Modes d’action: Sécrétion de cytokines pour • Activer d’autres lymphocytes (Tc, B) et les CPA (Monocyte/Macrophage/Cellule dendritique)

    34. Lymphocytes TA • Un Lymphocyte TA possède des RCT avec unparatope capable de reconnaître unépitopeassocié auCMHII • Cette cellules reconnait seulement cet épitope toute sa vie • Elle ne pourra pas reconnaitre d’autres épitopes • Pour reconnaître un autre épitope on a besoin d’un autre lymphocyte TA avec un paratope spécifique pour ce nouvel epitope • C’est la raison pour laquelle on a un répertoire élevé

    35. TA TA TA TA TA CD4 CD4 CD4 CD4 CD4 RCT Paratope Amplification clonale Présentation aux Cellules TA CMHII TA CD4 TA CD4 CPA

    36. 3e Ligne-Le Système Adaptatif • Caractéristiques: • Spécifique • Acquiert une mémoire après une première rencontre • Capable d’apprendre et de s’améliorer suite à des infections subséquentes • Contrairement ou système innée il fait la discrimination entre le “soi” et le “non-soi”

    37. Deux Fronts Extracellulaire • Réponse Humorale • Antigènes exogènes: • Bactéries • Virus • Mycètes • Parasites • Toxines Intracellulaire • Réponse Cellulaire • Antigènes endogènes: • Quelques bactéries • Ex. Mycoplasmes • Mycobactérium • Virus

    38. Participants Cellulaires • CPA • Lymphocytes B, monocytes, macrophages et cellules dendritiques • Lymphocytes Ta (T auxiliaire) • TH1: Réponse cellulaire (contre antigène endogène) • TH2: Réponse humorale (contre antigène exogène) • Lymphocytes B • Réponse Humorale (contre antigène exogène) • Lymphocytes Tc • Réponse cellulaire (contre antigène endogène)

    39. La Réponse Humorale • Choisir un lymphocyte B avec un RCB qui reconnait un épitope de l’antigène • C’est la sélection clonale • Si l’antigène se lie à la RCB, l’endocytose du complexe RCB-Ag se fait • Ensuite il y a digestion du complexe RCB-Ag • Présentation d’épitopes complexés sur le CMHII à des cellules TH2 avec RCT approprié préalablement activées • Donc c’est la deuxième fois que la TH2 se fait présenter l’Ag • La TH2 secrète des cytokines pour activer le lymphocyte B • Ensuite l’activation du lymphocyte B fait l’amplification clonale et se différence en plasmocytes et cellule B mémoire

    40. Y Y RCB IgM & IgD membranaire Y Y Y Lymphocytes B • Un Lymphocyte B possède un RCB capable de reconnaître un épitope avec un paratope • Le RCB est formé de 2 isotypes d’anticorps • IgM & IgD membranaire • C’est une molécule présentatrice • Donc elle possède un CMHII • Les lymphocytes B secrètent aussi des molécules effectrices (Anticorps) • 5 isotypes: IgD, IgM, IgG, IgA, IgE

    41. La Réponse Humorale • Les plasmocytes secrètent des anticorps • Une cellule peu seulement produire des anticorps avec un paratope (le même paratope que la cellule mère) • Elle ne peut pas changer le paratope ni l’épitope qu’il reconnait • Les cellules B mémoire gardent une mémoire pour l’épitope • Cela fait aussi que la représentation de cette cellule est plus grande • Donc la prochaine réponse est plus rapide

    42. Antigène Activation La Réponse Humorale Y TH2 Activée Épitopes CMHII RCB: IgM ou IgD Cytokines Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y P M P M P P Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Répertoire de lymphocytes B Naïf Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Amplification clonale et différentiation Sécrétion d’Ac Y Y Y B Mémoires Plasmocytes Y Y Y Y Y Y Y Y Y

    43. Les Anticorps (Immunoglobulines) Sites de liaisons d’épitopes antigéniques Chaîne lourde Chaîne légère Isotype Idiotype Région variable 2 X Fab Région constante Liens disulfures Région variable Région constante 1 X Fc

    44. Les Anticorps (Immunoglobulines) • Fab (Fragment Antigen Binding) • Région responsable de la reconnaissance de l’épitope • N’est pas responsable de la fonction • Fc (Fragment constant) • Région responsable de la fonction • N’est pas implique dans le reconnaissance

    45. Immunoglobulines - Cinq Isotypes Déterminé par la région Constante Confère fonctionnalité IgD IgM IgG IgA IgE Les cellules B peuvent produire 5 isotypes (Le mode d’action des Ac est déterminé par l’isotype) Mais seulement 1 idiotype (resposable de la reconnaissance de l’epitope)

    46. IgD • Monomère valence de 2 • Peut reconnaitre 2 molecules d’un même epitopes • Ac exclusivement membranaire • Pas secrété • Ac de surface des cellules B • Represente le RCB

    47. Pentamère (valence de 10) Anticorps de surface RCB Forme membranaire mais peut être secrété Premier Ac sécrété Fixation du complément Agglutinant Agit comme étiquette (ADCC)reconnue par cellules NK IgM

    48. IgG • Monomère (valence de 2) • Ac sérique prédominant • Plus abondant dans le sérum • Le seul que peut traverser le placenta • Donc peu protéger le fétus • Fait la fixation du complément • Région Fc est une opsonine • Reconnue par phagocytes • Agit comme étiquette (ADCC)reconnue par cellules NK

    49. IgA • Dimère (valence de 4) • Principalement associé aux muqueuses • Dans les orifices (la bouche, le nez, l’anus, etc..) • Neutralisant et agglutinant

    50. IgE • Monomère • Secrété par les lymphocyte B • Leurs régions Fc se lient aux membranes des macrophages, basophiles et mastocytes • Deviennent donc des Ac membranaires • Impliqué dans les réactions allergiques • Ces cellules du système innée acquièrent des récepteurs qui les rendent spécifiques