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1 GUS 染色原理

1 GUS 染色原理. 来自于大肠杆菌 K- 12 菌株的 β- 葡萄糖醛酸乙酰转移酶基因（ gus ）是应用较为广泛的报告基因，其产物葡萄糖苷酶（ β-glucuronidase) 与 5- 溴 -4- 氯 -3- 吲哚 -β-D- 葡萄糖苷酸酯 (5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-glucuronic acid, X-Gluc) 底物发生作用，产生蓝色沉淀反应，既可以用分光光度法测定，又可以直接观察到植物组织由沉淀形成的蓝色斑点，检测容易、迅速并能定量，只需少量的植物组织即可在短时间内测定完成。. 1.1 GUS 酶活性检测

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1 GUS 染色原理

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  1. 1 GUS 染色原理 • 来自于大肠杆菌K- 12 菌株的β-葡萄糖醛酸乙酰转移酶基因（gus）是应用较为广泛的报告基因，其产物葡萄糖苷酶（β-glucuronidase)与5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷酸酯(5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-glucuronic acid, X-Gluc)底物发生作用，产生蓝色沉淀反应，既可以用分光光度法测定，又可以直接观察到植物组织由沉淀形成的蓝色斑点，检测容易、迅速并能定量，只需少量的植物组织即可在短时间内测定完成。

  2. 1.1 GUS酶活性检测 • gus基因存在于某些细菌体内，编码β-葡萄糖苷酸酶（β-glucuronidase，GUS），该酶是一种酸性水解酶，能催化许多β-葡萄糖苷酯类物质的水解。因为绝大多数植物细胞内不存在内源的GUS活性，因此gus基因尤其应用在研究外源基因瞬时表达的转化实验中。此外，gus基因3’端与其他结构形式的融合基因也能够正常表达，所产生的融合蛋白仍具有GUS活性，这对研究外源基因表达的具体细胞部位提供了方便条件，也是它相对于其他报告基因的一个优点。

  3. 1.2 GUS检测方法 • GUS的水解产物具有发色团或可形成荧光物质，可用分光光度，荧光和组织化学的方法检测。 • 1.2.1 组织化学染色定位法 • 1.2.2 荧光法（定量） • 1.2.3 分光光度法测定GUS活性

  4. 1.2.1 组织化学染色定位法 • 该法以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D葡萄糖苷酸酯（X-Gluc）为底物，通过显色反应可直接观察到组织器官中gus基因的活性。该方法不用将酶从组织中提取出来，而是使底物进入被测的植物组织、细胞或原生质体之中。将被测材料浸泡在含有底物的缓冲液中保温，若组织、细胞、原生质体发生了gus基因转化，表达出GUS，在适宜条件下该酶可将X-Gluc水解生成蓝色物质，初始产物并不带颜色，为无色的吲哚衍生物，后经氧化二聚作用形成5,5’-二溴-4,4’-二氯靛蓝染料，此靛蓝染料使具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色，可用肉眼或在显微镜下观察到。

  5. 1.2.2 荧光法（定量） • 以4-甲基伞形酮酰-β-D葡萄糖醛酸苷（4-MUG）为底物，GUS催化其水解为4-甲基伞形酮（4-MU）及β-D葡萄糖醛酸。 4-MU分子中的羟基解离后被365nm的光激发，产生455nm的荧光，可用荧光分光光度计定量。

  6. 具体测定时有两种做法: • ①仅在一个时间上测定溶液的总荧光量，测定时要设对照，以消除内源荧光强度； • ②测定酶反应不同时间溶液荧光量（荧光法十分灵敏，微小的增加量也可以测定出来）。在酶反应初始阶段，酶作用生成的荧光物质在反应体系中处于积累阶段，荧光产物与时间有线性关系，而内源性荧光物质的荧光量与时间无此种关系，因而可通过测定酶反应初始阶段几个时间的荧光量，得到的线性关系即可作为酶活力的依据。

  7. 1.2.3 分光光度法测定GUS活性 •     对硝基苯β-D-葡萄糖醛酸苷（PNPGluc）是该法的最好底物，GUS将其水解，生成对硝基苯酚，在pH7.15时离子化的发色团吸收400～420的光，溶液呈黄色，酶反应在pH7.0条件下进行，随反应进行，产物生成，逐渐碱化，显色增强。以对硝基苯酚为标准样品，分别在反应开始后不同时间取样，终止反应后于415nm测吸收值。这种方法简单，无需复杂仪器，但其灵敏度不高，可通过延长反应时间来增强显色。

  8. Scale bars 100 m. GUS activity in the shoot of Arabidopsis A: mature trichomes (表皮毛）; C, cotyledon guard cells (子叶和保卫细胞); D, stipules （托叶）; H, veins of cotyledon and hypocotyl (胚轴); N, veins of hypocotyl and cotyledon petiole（叶柄）; P, cotyledon and leaf blade (子叶和叶片)

  9. 2 GUS 定性实验操作内容简介 • 2.1试剂 • 100mM phosphate buffer(pH 7.0) • 100mM Fericyanate stock • X-Gluc 母液：50mg/ml(X-Gluc/DMSO)避光-20℃贮存。 • Staining buffer： X-Gluc, 0.1% TritonX-100, Fericyanate 0.5mM， phosphate buffer(50mM, pH 7.0) -20℃贮存。 • 70％乙醇。

  10. 2.2 操作步骤 • 将准备好的材料冲洗干净，用吸水纸吸干，浸在上述染色液中37℃恒温条件下保温过夜 • 转入70％乙醇中脱色2－3次，去除叶绿素，至阴性对照材料呈白色时为止。 • 肉眼或显微镜下观察，白色背景上的兰小点即为Gus基因表达的位点。 • 显微镜下观察、拍照。

  11. 2.3 注意事项 • 要设立严格的阴性对照，即用同样的未转化的材料按相同的方法同时进行染色。如阴性对照显示兰色，其原因可能是：A）材料和试剂被细菌感染；B）保温时间过长。 • 染色液中添加甲醇可抑制细菌生长，长时间染色可加入0.02% NaN3或100mg/ml的氯霉素，短时间染色也可以不加。 • 叶绿体含量高的材料染色后要进行脱色。

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