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  1. Universidade Estadual do Ceará – UECE Centro de Ciências da Saúde - CCS Curso: Ciências Biológicas Disciplina: Bioquímica Professor: Luís Flávio ELETROFORESE (Em gel de agarose)‏ Elitha Gardênia Paulino Stela Mirla Acácio Fortaleza 2010

  2. Conceito “Eletroforese em gel: é uma técnica de separação de moléculas que envolve a migração de partículas em um determinado gel durante a aplicação de um potencial elétrico. As moléculas são separadas de acordo com a sua carga elétrica e seu peso molecular, logo as de menor massa irão migrar mais rapidamente que as de maior massa”. A eletroforese normalmente é utilizada para separar proteínas e moléculas de DNA e RNA.

  3. Breve Histórico... • Inicialmente proposta por Arne Teselius (1937). • A eletroforese era técnica empregada para visualização de proteínas com suas diferenças de comprimento de fragmentos de aminoácidos e cargas elétricas. • Atualmente, o uso desta técnica é comum também para estudos com ácidos nucléicos (Brown 1998; Farah 2000), na visualização de material genético (ácido desoxirribonucléico e ribonucléico, DNA e RNA). Arne Tiselus Prêmio Nobel de Química em 1948

  4. Princípios da Eletroforese O princípio da eletroforese utilizada para separação de DNA, baseia-se na carga total negativa do DNA (dada pelos oxigênios do grupamento fosfato). Assim, fragmentos de DNA obtidos da técnica de PCR, podem ser separados pela aplicação de uma voltagem. Ao final do processo, as cadeias de DNA estarão próximas ao pólo positivo.

  5. Princípios da Eletroforese 1.Separar partículas por diferença de carga e massa 2.Aplicaçao de corrente elétrica sobre o gel 3.Isolar fragmentos de DNA, RNA e proteínas

  6. Equipamentos • Cuba Eletroforética • Fonte de eletricidade • Suporte para o gel • Pentes • Pipetas

  7. Equipamentos

  8. Equipamentos

  9. Gel de Agarose • Agarose é um polissacarídeo extraído de alga marinha. • Não-tóxico. • Fácil de preparar. • Possuem ampla capacidade de separação,mas baixa resolução. • Dependendo da concentração podem separar fragmentos de DNA de 200 a 50.000 bp, via eletroforese. • Custo elevado. • Ao solidificar, após o aquecimento, os longos filamentos de agarose formam uma matriz (malha) que serve de "peneira" de separação de fragmentos de DNA. .

  10. Gel de Agarose • Alguns fatores determinam a migração do DNA através do gel de agarose: a) tamanho da molécula de DNA b) concentração da agarose c) conformação do DNA (formas circulares ou lineares) d) a presença de brometo de etídio no gel e) voltagem aplicada f) tipo de agarose g) tipo do tampão de eletroforese

  11. Soluções e Reagentes • Tampão O gel é submerso em um tampão que possui íons para a corrente passar e também para manter o pH mais ou menos constante. a) TAE (Tris-acetate-EDTA electrophoresis buffer – Tampão de eletroforese-Tris-acetato-EDTA) b) TPE (Tris-phosphate-EDTA lectrophoresis buffer Tampão de eletroforese-Tris-fosfato-EDTA)‏ c) TBE (Tris-borate-EDTA electrophoresis buffer Tampão de eletroforese-Tris-borato-EDTA)‏

  12. Soluções e Reagentes • Tampão de carregamento (loading buffer)‏ É uma solução composta de azul de bromofenol (e/ou xileno cianol ) e glicerol, é misturado às amostras antes de carregar o gel e possui três finalidades: 1) aumentar a densidade da amostra 2) adicionar cor às amostras 3) simplificar o processo de carregamento

  13. Soluções e Reagentes • Coloração do gel: 1) Brometo de etídio O brometo de etídio intercala-se com a molécula de DNA a cada 2,5 bp do fragmento, após sua inserção esse exerce uma ligação do tipo Van der Waals. A radiação UV é capaz de estimular essa ligação entre o DNA e o corante tornando a molécula ou banda visível no gel através de um dispositivo de transiluminação. Como o brometo de etídio se intercala no DNA, esta substância tem um poderoso efeito mutagênico e, possivelmente pode ser cancerígeno ou teratogênico.

  14. Marcadores de peso molecular A distância que o fragmento percorre a partir do ponto de aplicação é comparada com a distância que outros fragmentos de tamanhos conhecidos percorreram no mesmo gel. Esses fragmentos são os ladders (marcadores de peso molecular), misturas de segmentos de DNA de tamanhos variáveis e eqüidistantes entre si, e que são aplicados em um poço no gel no início do processo. .

  15. Montando a Eletroforese • Preparação do Gel de Agarose 1. Para 100mL de gel, pesar 0,8g de agarose. 2. Adicionar 100mL de TAE 1X. 3. Fundir a solução no microondas até homogeneizar (sugestão: 2 a 2,5 min, potência 7). 4. Enquanto a solução de gel esfria (morno), preparar o suporte de gel, selando as laterais com fita crepe ou na própria cuba. 5. Acrescentar 5μL de Brometo de Etídeo (10mg/mL) e misturar com agitação leve. 6. Despejar a solução de gel no suporte sem fazer bolhas. 7. Colocar o pente da espessura desejada no suporte. 8. Esperar a solução solidificar. 9. Colocar o suporte com o gel na cuba de eletroforese.

  16. Montando a Eletroforese • Preparação das Amostras (DNA) 1. Extrair 3μL da amostra de DNA. 2. Homogenizar com 1μL de tampão de corrida 5X (Loading Buffer). 3. Aplicar as amostras nos poços. 4. Reservar 2 poços para utilização de um padrão de corrida (Ladder-1Kb).

  17. Montando a Eletroforese • Montar a Cuba Eletroforética • Adicionar o gel, previamente preparada • Adicionar tampão TAE 1X até cobrir a superfície do gel. • Adiciona as amostras a serem separadas • Ajustar a voltagem desejada(média 80v) e ligar a cuba

  18. Eletroforese em gel • Eletroforese em gel de poliacrilamida: apoliacrilamida é uma mistura de dois polímeros, acrilamida e bisacrilamida. A acrilamida é uma molécula linear, enquanto que a bisacrilamida é em forma de "T". Misturando essas duas moléculas, temos a formação de uma "rede".O gel de poliacrilamida tem maior capacidade de resolução e é mais efetivo para separar pequenos fragmentos de DNA (5-500 bp – pares de base). • Eletroforese Desnaturante: normalmente feita em gel de agarose, inclui um agente desnaturante (normalmente uréia), o que ajuda a tornar a separação melhor entre moléculas que apresentam diferenciação em suas estruturas secundárias.

  19. Eletroforese em Gel • Eletroforese capilar: Funciona como a eletroforese normal, porém o gel e a amostra estão dentro de um capilar, e a amostra é detectada automaticamente por um detector. Isso possibilita a automação do processo. Essa é a eletroforese atualmente utilizada em seqüenciadores de DNA.

  20. Visualização após a Eletroforese . Correndo o DNA em um gel tratado com EtBr e olhando sob UV podemos ver as bandas de DNA.

  21. Visualização após a Eletroforese .

  22. Visualização após a Eletroforese .

  23. Visualização após a Eletroforese .

  24. . Visualização após a Eletroforese SYBR Green > Molecular Probes 1995 Revolucionou a detecção de DNA em géis. A intensidade da fluorescência do SYBR Green é aumentada em 100X quando se liga ao DNA. Consegue-se ver picogramas de DNA. Junto a sua sensibilidade superior o SYBR Green tem outras vantagens sobre o EtBr: - É muito menos mutagênico, - Pode ser adicionado diretamente à amostra antes da eletroforese.

  25. “O homem que à ciência quer dedicar seu tempo e amor, tem pelo menos três certezas na vida: primeira, que morrerá como todo mundo; segunda, que não ficará rico, como quase todo mundo e, por fim, que se divertirá muito, como pouca gente”. Prof. Dr. Newton Freire. Departamento de Genética UFRS.

  26. OBRIGADA!!! diponível em: www.mirla.com.br