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Approches méta-génomiques en Microbiologie

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  1. Approches méta-génomiques en Microbiologie • Pascal SIMONET • Ecologie Microbienne, Univ. Lyon1-CNRS • Laboratoire Ampère, ECL-CNRS Pascal.simonet@ec-lyon.fr

  2. CONTEXTE

  3. Microorganismes • Eucaryotes microscopiques • Procaryotes Whitman et al. 1998 PNAS, 95, 6578-6583. Prokaryotes: The unseen majority. 4-6 x 1030 cellules bactériennes 1,2 x 1029 Océan 2,6 x 1029 Sol 3,5 x 1030 Sol profond 0,25 - 2,5 x 1030 Sous sol océanique

  4. The diversity of life

  5. Overview • Microbes dans l’environnement • Microorganismes (bactéries, archaea, champignons, levures) colonisent tous les écosystèmes de notre planète. • Un gramme de sol de jardin >100 000 000 cellules microbiennes (100 – 1000 espèces différentes). • Le corps humain: 1 milliard de cellules microbiennes. • Microorganismes: impliqués dans tous les processus globaux • Microorganismes: Rôle fondamental en Biotechnologie (e.g., antibiotiques, fermentation, expression, bioremédiation).

  6. Despite temperatures ranging from –5 to –70oC and water contents below 2%, Antarctic terrestrial soils contain 106 – 108 cells per gram.

  7. Large populations of hyperthermophilic bacteria and archaea live in boiling hydrothermal systems.

  8. Approches traditionnelles en microbiologie Culture in vitro Collections de microorganismes: - Laboratoires académiques - Organisations privées ou publiques ATTC (USA) LMG (Belgique) DSM (Allemagne) I. Pasteur (France) - Laboratoires industriels

  9. Isolats bactériens Problèmes d’identification Problèmes de caractérisation Problèmes de taxonomie Problèmes d’évolution (transferts latéraux de gènes) Problèmes d’accessibilité Problèmes de représentativité (1% de cultivés) Problèmes de conservation Problèmes de criblage

  10. Approches « métagénomiques » en microbiologie PRINCIPE ADN microbien « environnemental ». Extraction, Purification, Exploitation Identification, caractérisation, fonctions et exploitation des bactéries non cultivées.

  11. Lyse in situ et extraction directe de l’ADN (total), purification. • Extraction des cellules bactériennes, purification, lyse, purification de l’ADN. Source ? • Sélection PCR: Banques de séquences 16S rDNA. • Clonage direct: Banques d’ADN métagénomique • Séquençage direct

  12. Extraction d’ADN des bactéries (métagénome) Clonage Transformation dans hôte cultivable vecteur ADN métagénomique Banque d’ADN métagénomique Séquençage direct (shotgun) PCR Culture in vitro RISA, T-RFLP DGGE Criblage moléculaire Criblage biologique Criblage chimique Clonage séquençage Détermination de la structure chimique des molécules produites Détection de gènes par hybridation Caractérisation Comparaison de différentes situations environnementales Isolement in vitro de bactéries cultivables Phylogénie Estimation de la diversité bactérienne (17) Détection directe d’activité antibactérienne ou enzymatique

  13. Renaud NALIN nalin@libragen.com 3 rue des Satellites 31400 Toulouse Création et exploitation de banques d’ADN métagénomique

  14. ATOUTS et LIMITES

  15. Génomique: Définition C'est l'étude exhaustive des génomes et en particulier de l'ensemble des gènes, de leur disposition sur les chromosomes, de leur séquence, de leur fonction et de leur rôle. Séquençage massif, Méthodes bio-informatiques Post-génomique Sciences en « iques », transcriptomique, protéomique, métabolomique etc…

  16. « Méta -génomique » en Microbiologie ?? Sensu stricto non, mais… Sensu latoUtilisation de l’ADN oui

  17. Eaux de drainage des mines de fer Couverture par banque d’ADN métagénomique de 80 x106 pb (23 000 clones) Génome quasi complet Leptospirillum sp. et Ferroplasma sp. et le Génome partiel de 3 autres bactéries. Tyson GW et al. (2004) Nature 428, 37-43

  18. Eaux de drainage des mines de fer Couverture par banque d’ADN métagénomique de 80 x106 pb (23 000 clones) Génome quasi complet Leptospirillum sp. et Ferroplasma sp. et le Génome partiel de 3 autres bactéries. Tyson GW et al. (2004) Nature 428, 37-43 Sols cultivés ou forestiers: 109 cellules par gramme 10 000 espèces génomiques dominantes différentes 9 millions de clones (pour des inserts moyens de 40 kb) nécessaires pour un représentant de chaque espèce. Banque métagénomique d’un sol de prairie (100 000 clones) Taille totale de l’ADN cloné : 3,5 x 109 pb 5% de la diversité totale (x24 /techniques de culture) Ginolhac A et al. (2003) Appl Environ Microbiol 70, 5522-5527

  19. Extraction et purification de l’ADN environ. Frostegard A., Courtois S., Ramisse V., Clerc S ., Bernillon D., Le Gall F., Jeannin P., Nesme X. and Simonet P. 1999. Quantification of Bias Related to the Extraction of DNA Directly from Soils. Appl. Environ. Microbiol., 65 : 5409-5420. Lyse cellulaire ?? Taux de récupération de l’ADN ??

  20. APPLICATIONS

  21. Extraction d’ADN des bactéries (métagénome) Clonage Transformation dans hôte cultivable vecteur ADN métagénomique Banque d’ADN métagénomique Séquençage direct (shotgun) PCR Culture in vitro RISA, T-RFLP DGGE Criblage moléculaire Criblage biologique Criblage chimique Clonage séquençage Détermination de la structure chimique des molécules produites Détection de gènes par hybridation Caractérisation Comparaison de différentes situations environnementales Isolement in vitro de bactéries cultivables Phylogénie Estimation de la diversité bactérienne (17) Détection directe d’activité antibactérienne ou enzymatique

  22. Criblage moléculaire d’une banque d’ADN métagénomique par hybridation de colonies Criblage moléculaire

  23. Type I PKS (PKSI) La structure des polyketides produits par les PKSI est liée à leur organisation linéaire en domaines et modules.

  24. Sol Criblage de banques d’ADN métagénomique (sol) • 60 000 clones 139 « KS » +++ • 40 « KS » séquencés Pas de redondance • Nouveauté totale • (similarité < 67%) Ginolhac A., Jarrin C., Gillet B., Robe P., Pujic P., Tuphile K., Bertrand H., Vogel T. M., Perriere G., Simonet P., and Nalin R 2004. Phylogenetic Analysis of Polyketide Synthase I Domains from Soil Metagenomic Libraries Allows Selection of Promising Clones. Appl. Environ. Microbiol. 2004;70 5522-5527

  25. Extraction d’ADN des bactéries (métagénome) Clonage Transformation dans hôte cultivable vecteur ADN métagénomique Banque d’ADN métagénomique Séquençage direct (shotgun) PCR Culture in vitro RISA, T-RFLP DGGE Criblage moléculaire Criblage biologique Criblage chimique Clonage séquençage Détermination de la structure chimique des molécules produites Détection de gènes par hybridation Caractérisation Comparaison de différentes situations environnementales Isolement in vitro de bactéries cultivables Phylogénie Estimation de la diversité bactérienne (17) Détection directe d’activité antibactérienne ou enzymatique

  26. Hôtes d'expression Streptomycescoelicolor Vecteurs Escherichia coli Bacillus subtilis Pseudomonas fluorescens

  27. Criblage chimique Banques d’ADN métagénomique ou Hôtes d'expression? Développement de vecteurs navettes A second generation snp-derived Escherichia coli–Streptomyces shuttle expression vector that is generally transferable by conjugation Nikodinovic, Priestley, Plasmid 56 (2006) 223–227

  28. Extraction d’ADN des bactéries (métagénome) Clonage Transformation dans hôte cultivable vecteur ADN métagénomique Banque d’ADN métagénomique Séquençage direct (shotgun) PCR Culture in vitro RISA, T-RFLP DGGE Criblage moléculaire Criblage biologique Criblage chimique Clonage séquençage Détermination de la structure chimique des molécules produites Détection de gènes par hybridation Caractérisation Comparaison de différentes situations environnementales Isolement in vitro de bactéries cultivables Phylogénie Estimation de la diversité bactérienne (17) Détection directe d’activité antibactérienne ou enzymatique

  29. Environnement marin Venter et al. 2004. Environmental Genome Shotgun Sequencing of the Sargasso Sea. Science 304, 66-74. 1800 espèces génomiques 148 phylotypes bactériens inconnus

  30. Nucleic Acids Research, 2006, Vol. 34, No. 19 5623–5630 Bioinfo MetaGene: prokaryotic gene finding from environmental genome shotgun sequences Hideki Noguchi*, Jungho Park and Toshihisa Takagi Department of Computational Biology, Graduate School of Frontier Sciences, University of Tokyo, Kashiwa, Chiba 277-8562, Japan MetaGene can predict a whole range of prokaryotic genes based on the anonymous genomic sequences of a few hundred bases, with a sensitivity of 95% and a specificity of 90% for artificial shotgun sequences (700 bp fragments from 12 species).

  31. Extraction d’ADN des bactéries (métagénome) Clonage Transformation dans hôte cultivable vecteur ADN métagénomique Banque d’ADN métagénomique Séquençage direct (shotgun) PCR Culture in vitro RISA, T-RFLP DGGE Criblage moléculaire Criblage biologique Criblage chimique Clonage séquençage Détermination de la structure chimique des molécules produites Détection de gènes par hybridation Caractérisation Comparaison de différentes situations environnementales Isolement in vitro de bactéries cultivables Phylogénie Estimation de la diversité bactérienne (17) Détection directe d’activité antibactérienne ou enzymatique

  32. Sol (extrême) • « Sols » chimiquement déséquilibrés Carence en éléments essentiels C, N, P … Ni Cr, Co, Fortes teneurs en métaux lourds Gènes de résistance au nickel Modèle : Déblais de mines de nickel en Nouvelle-Calédonie Fall, Herrera, Helassa, Bernillon, Simonet, Vogel, Navarro

  33. 50Kb 8 mM 8 mM Banques plasmidiques Banques cosmidiques Taille des fragments : 2-9Kb Taille des fragments : 20-40Kb 2 clones MS1 et MS2 3 clones MS3, MS7 et MS43

  34. 10 1 8 8 1 1 1 MS3 ORF1 ORF2 ATPase E1-E2 nreA nreB HP HP RT MS7/43 chrA chrB NicO DedA nreB rcnA nreA ORF1 ORF2 wcaK ORFs impliqués dans la résistance au nickel : nreB - rcnA

  35. Environnement humain Determining the antibiotic resistance potential of the indigenous oral microbiota of humans using a metagenomic approach Diaz-Torres et al. 2006FEMS Microbiol Lett 258, 257–262 Bouche: Prévalence de nombreux gènes de résistance aux antibiotiques

  36. Symbiosis insights through metagenomic analysis of a microbial consortium Woyke et al. 2006, Nature Vol 443, 26 October 2006 Olavius algarvensis, (vers marin) Microsymbiontes remplacent bouche et tube digestif Animal Microbial diversity in the deep sea and the underexplored ‘‘rare biosphere’’ Sogin et al. 2006, PNAS vol. 103 no. 32 12115–12120 Grande profondeur: Complexité jusqu’à 2 ordres de grandeur > autres environnements. Des milliers de populations faiblement représentées Fosses océaniques Metagenomic Analysis of Coastal RNA Virus Communities Culley et al. 2006,SCIENCE VOL 312 23 JUNE 2006 Océans: un réservoir de virus à ARN inconnus Marin

  37. Méta-génomique comparative 22 APRIL 2005 VOL 308 SCIENCE Comparative Metagenomics of Microbial Communities Tringe,1,2* von Mering,3* Kobayashi,1 Salamov,1 Chen,4 Chang,5 Podar,5 Short,5 Mathur,5 Detter,1 Bork,3 Hugenholtz,1 Rubin1,2. 1Department of Energy (DOE) Joint Genome Institute, 2800 Mitchell Drive, Walnut Creek, CA 94598, USA. 2Lawrence Berkeley National Laboratory, Genomics Division, Berkeley, CA 94720, USA. 3European Molecular Biology Laboratory, Meyerhofstrasse 1, 69117 Heidelberg, Germany. 4University of California, Berkeley, Department of Electrical Engineering and Computer Science, Berkeley, CA 94720, USA. 5Diversa Corporation, 4955 Directors Place, San Diego, CA 92121, USA « The identification of environment-specific genes through a gene-centric comparative analysis presents new opportunities for interpreting and diagnosing environments. »

  38. Gut. 2006 Feb;55(2):205-11. Tube digestif Reduced diversity of faecal microbiota in Crohn's disease revealed by a metagenomic approach. C Manichanh, L Rigottier-Gois, E Bonnaud, K Gloux, E Pelletier, L Frangeul, R Nalin, C Jarrin, P Chardon, P Marteau, J Roca and J Dore INRA, Genoscope, Genopôle IP, LibraGen etc Six healthy donors and six patients with CD. Bacterial diversity (16S rRNA gene). A reduced complexity of the bacterial phylum Firmicutes as a signature of the faecal microbiota in patients with CD. Presence of new bacterial species.

  39. ADN environ. Ecologie µbienne Environ. Détecter, identifier, localiser, compter les µorganismes. Identifier des gènes / Déterminer des activités potentielles. Exploiter des ressources génétiques. Applications méta-génomique?

  40. BioTechniques 41:183-188 (August 2006) Analyse génomique Improved inverse PCR scheme for metagenome walking Taku Uchiyama and Kazuya Watanabe Marine Biotechnology Institute, Kisarazu, Japan