Kl ónozás fogalma

1. Klónozás fogalma Egy általunk kiválasztott DNS darabot vektor segítségével gazdasejtbe juttatunk és ott felszaporítunk Szubklónozás: további kisebb darabok hasonló felszaporítása vektor Hasítás, A,B enzimekkel Hasítás, A,B enzimekkel A inszert B A ligálás B Transzformálás, felszaporítás, tisztítás Vektor: olyan nukleinsav hordozó, amellyel nukleinsavakat sejtbe lehet juttatni, Felhasználás: klónozás, fehérje termeltetés, genetikai manipulációk stb.

2. rezisztencia marker replikációs origo ORI KÓNOZÁSBAN ÁLTALÁNOSAN HASZNÁLT VEKTORTÍPUSOK inszert méret példa plazmidok pUC18,19 < 10 - 15 kb fonalas fágok mp18, 19 < 5 - 10 kb fagemidek pBluescriptKS, SK± < 10 - 15 kb l fágok EMBL3,4 néhányszor 10 kb kozmidok pHC79 néhányszor 10 kb néhány 100 kb BAC, YAC pBAC108L, pYAC3 BAC, YAC: bacterial, yeast artificial chromosome PLAZMIDOK Cirkuláris kettősszálú extrakromoszómális elemek

5. Egy ősi plazmid: pBR322

6. Replikációs kontroll

7. Magas kópiaszámú változat: pUC19

8. Inszertet tartalmazó klónok kiválasztása • antibiotikum rezisztencia, ld. pBR3222, két antibiotikum, az egyik elromlik, ha inszert épül be, fáradtságos szurkálások, két antibiotikum rezisztencia gén szükséges • kolónia hibridizáció, univerzális mindig használható • plazmid tisztítás, térképezés restrikciós emésztéssel hosszú fáradtságos • polimeráz láncreakció sejteken, kombinatorikus • gyors ha nincs más szelekció • kék fehér színszelekció, • pozitív szelekciós vektorok, kondicionálisan letális gén a vektoron, az inszert beépül, elrontja a gént  megszűnik a letalitás • auxotrofiát komplementáló génbe történő klónozás ugyanaz a probléma, mint az antibiotikumok esetén

9. Kolónia hibridizáció

10. LacZ a komplementáció F' plazmidon: defektív b- galaktozidáz gén, hiányzik 11- 41. aminosav közötti régió bevitt vektor: tartalmazza a lacZ szabályozó régiót és az 1-146 aminosavat a kettő együtt: aktív b – galaktozidáz X-gal szubsztráttal kék telep a bevitt N-terminális fragmentben : polilinker régió (leolvasási keret marad) ebbe lehet klónozni fragmentumot, ha kis fragmentum és leolvasási keret nem romlik el  X-gal szubsztráttal kék telep, ha elromlik vagy nagy fragment  X-gal szubsztráttal fehér telep

11. Egy pozitív szelekciós vektor

12. Vektor önligálását, üres vektorok képződését gátló módszerek • kondicionálisan letális gének használata • vektor defoszforilálása • korrekt vektor/inszert arány megválasztása A ligáz csak 5’ foszfát – 3’ OH végeket tud összekapcsolni, ha a vektort defoszforiláljuk, nem tud önligálódni

15. PLAZMIDOK SEJTBE JUTTATÁSÁNAK MÓDJAI 1. Kémiai transzformálás Kompetens sejt: a DNS felvételére alkalmassá tett sejt A sejteket felnövesztés után centrifugáljuk speciális kétértékű kationokat (Ca2+, Mn2+) tartalmazó oldattal kezeljük, sejtfalpermeabilitást növelő ágenst (DMSO) adunk hozzá transzformációs hatékonyság: transzformáns /µg DNS elvi szám a transzformációt£ 1 ng mennyiségű DNS-sel hajtjuk végre : normál érték: 106 – 108 nagyon jó: 109 • a transzformáció hatékonyságát meghatározó tényezők: • oldatok edények tisztasága, • - sejtek növekedési sebessége, a növesztés fázisa, hőmérséklete • hősokk hőmérséklete hossza • permeabilizáló faktor a lineáris DNS transzformációs gyakorisága kb 2 nagyságrenddel alacsonyabb, mint a cirkulárisé • egyéb fogások: • spheroplast készítés ozmotikum jelenlétében és ezttranszformáljuk • - a DNS-t liposzómába csomagoljuk transzfomálás előtt

16. Transzformálás hatékonyságát meghatározó tényezők I. glicerin koncentráció, puffer pH, puffer koncentráció, sók növesztési hőmérséklet, OD

17. Transzformálás hatékonyságát meghatározó tényezők II. hősokk hőmérséklete, hossza plazmid mérete tárolhatóság permealizáló ágens

18. Elektroporáció A sejteket felnövesztés után kis vezetőképességű, glicerines (nagy ellenállású  600 ) pufferben szuszpendáljuk nagy feszültségű impulzust adunk rá kb 5 ms-ig transzformációs hatékonység 20 - 50 x jobb (1010/µg DNS) sejttípusonként optimalizálni kell maghatározó faktorok: - az oldat ellenállása - az impulzus nagysága, hossza - permeabilizáló, redox potenciált befolyásoló faktorok adagolása

19. KONJUGÁCIÓ Sejtből sejtbe történő DNS átadás lépései: párosodás: speciális kontaktus a donor és a recipiens között egy speciális sejtfelszíni ponton keresztül (pl. pilus) DNS átjuttatását közvetítő folyamatok, replikcáció (rolling circle, az egyik szál átjutása) konjugációs elemek donorból donort csinál az első ilyen a a szex faktor, F episzóma másik: IncP csoportba tartozó: RP4, RK2 plazmidok (szilárd fázishoz mobilizálható plazmidok a recipiensből nem lesz donor a plazmid tartalmazza a DNS processzáló apparátust, oriT, mob régió tra gének, pilus: N-acetilált TraA

20. F pilus + F sejt - F sejt az F plazmid eltörik 5’ 3’ a DNS egyik szála átmegy a recipiensbe, mialatt a donorba a másik szál szintetizálódik 5’ 5’ 3’ 3’ DNS szintézis a recipiensben 5’ 3’ 3’ 5’ A DNS szintézis befejezõdik + F sejt a sejtek szétválnak F pilus + F sejt A KONJUGÁCIÓ MECHANIZUMSA

21. A DNS transzfer mechanizmusa a konjugáció során donor recipiens donor recipiens TraI 5’ 5’ TraI Töréspont, nick donor recipiens Egyszálú DNS kötő fehérje TraC primáz 5’ RNS primer Replikatív DNS polimeráz TraI

22. Térképezés konjugációval

23. A konjugációcélja “sima” konjugáció RP4 tra RP4 tra Konjugatív génátviteli stratégiák Akceptor konjugáció elõtt után vektor replikáció Donor az utód sejtben tra + RP4 mob Irányított mutagenezis, homológ rekombináción alapuló integráció - mob Random, transzpozon alapú mutagenezis - Tn5 mob

24. Mobilizálható vektorok Nem tartalmazzák a tra géneket, csak a transzferhez szükséges oriT-t tra gének: integrálva a kromoszómába, három komponensű konjugáció: sem a donor sejt sem a recipiens nem tartalmazza a transzferhez szükséges géneket, hanem egy harmadik sejt

25. Gének irányított szétroncsolása interpozon mutagenezis Ar1 oriV oriT oriV: szűk gazdaspecificitás Ar2 Ar: antibiotikum rezisztencia Ar2 Ar1 oriT oriV Ar2 vad típus mutáns poláris hatás

26. Deléciós mutagenezis a leolvasási keret sértése nélkül Ar1 oriV oriT oriV: szűk gazdaspecificitás Ar: antibiotikum rezisztencia Ar1 oriV oriT vad típus mutáns poláris hatás ?