Plasmacellen Immunglobuliner M-komponent undersøgelser

1. PlasmacellenImmunglobulinerM-komponent undersøgelser Afdelingsbioanalytiker Margit Grome KB3011, Rigshospitalet M-komponent

2. Plasmacelle Når en ikke-differentieret B-lymfocyt møder et antigen (og får signal fra en T-hjælpercelle) kan den differentiere sig til en plasmacelle eller en Hukommelses B-celle. Plasmacellen: Størrelse: Ca. 7-12 µm ( 6 – 30 µm ) Cytoplasma. Stærkt blåligt - Ingen granula Der ses lys”opklaringszone” ved kernekanten svarende til at veludviklet Golgi-apparat. Vacuoler kan ses.  Kerne: Den mørke blå/lilla kernen er rund el. oval, relativ lille, fylder 30-50 % af cellen. Ingen nukleoler. Kernens beliggenhed er excentrisk.Kromatinstrukturen er meget kompakt-groft klumpet. ( Hjul-eger”). ·        M-komponent

3. Myelomceller M-komponent

4. Plasmacellen: Referenceværdier i blod: • 0 % (når 100 celler differentialtælles). Referenceværdier i knoglemarv: • ca. 1% • ….øges bla. ved kraftig antigenpåvirkning • Plasmacellen producerer mange antistoffer 1000 – 2000 per sekund. M-komponent

5. Plasmacelle-leukæmi Kvinde, 69 år HgB: 5,5 mmol/l PLT: 18 milliard/l WBC: 60 milliard/l Ingen M-komponent Diagnose: Relapse af kendt plasmacelle-leukæmi, behandles nu med Velcade og Dexametason. . Plasmaceller (myelomceller) 45% M-komponent

6. Farvet CSV-Cytospin-præparat analyseret i DM96 Plasmaceller LYMF Plasmaceller i CSV kan ses ved div. tilstande ( fx Sklerose, betændelse (virus) i hjerne/rygmarv, borelia, syfilis) M-komponent

7. B-lymfocyttens udvikling: M-komponent

8. ”Lymfeknude-aktivitet” (eksempel): 5. B-celler der er specielt designet til at destruere Pneumococcus laver antistoffer, der passer til  bakterierne. 6. Nogle specialiserede B-celler (plasma celler) forstærker forsvaret ved at frigøre i tusindvis af antistoffer hvert sekund. M-komponent

9. Plasmacellen producerer immunglobuliner (antistoffer) • Et immunglobulin er opbygget af 2 tunge kæde, og 2 lette kæde. • Den tunge kæde bestemmer immunglobulinets klasse (IgG, IgA, IgM – samt IgD eller IgE). • Den lette kæde bestemmer immunglobulinets type (Kappa eller Lambda). Plasmacellen producerer lette kæder i overskud. (ca. 40%) • En M-komponentes klasse/type skrives: • fx: IgG; kappa eller IgA; lambda M-komponent

10. Immunglobulin (Ig)- grundstruktur: M-komponent

11. M-komponent

12. Normal plasmacelle: Ved antigen stimulation dannes i første omgang antistoffer af typen IgM. Efter et par uger syntetiseres antistoffer af typen IgG med samme specificitet. (Polyklonalt response) M-komponent

13. Myelomcellen: Ved fx myeolomatose, er det en undertype af plasmacellerne, som deler sig unormalt og uhæmmet. Der dannes derfor kun en type antistof – et monoklonalt respons. Også kaldet Para-protein. M-komponent

14. Molekylevægte (Dalton): M-komponent

15. 1 Dalton • A unit of mass for expressing masses of atoms, molecules, or nuclear particles. • It is equal to 1/12 the mass of a single atom of the most abundant form of carbon, carbon-12. • Dalton er en kemisk enhed opkaldt efter John Dalton  (1766-1844), der udviklede atomteorien for et stof. • 1 dalton (Da) er en masseenhed meget tæt på hydrogenatomets masse. M-komponent

16. M-komponent-undersøgelser KB 3011. • P-M-komponent; arb. stofk (0-1) …………trækker SERUM-Protein; massek. Evt. oprettes P-M-komponent; klasse/type og massek. • U-M-komponent; arb. stofk. (0-1) ………… trækker U-Protein; massek. + evt. oprettes klasse/type og stofk./masse • Hvis P-Immunglobulin G, A og M; massek er rekvireret tages disse med i bedømmelsen. M-komponent

17. Andre analyser: • .Pt. Plasma; viskositet (37 grader C) • og • P-Cryoglobulin; arb. stofk. (0 1 2 ) M-komponent

18. Statistik: M-komponent

19. Elektroforese (Tiselius 1930): Siden 2001 er analyser udført på semi-automatisk udstyr: Hydrasys/ HYRYS fra Sebia M-komponent

20. Hydrasys 2 (Netop taget i brug – ellers benyttede vi Hydrasys) : Scannings-modul Migrations-modul Farve-modul Migration: 20 W ved 20 ºC M-komponent

21. Protein B1/B2-Kit til serum- elektroforese : Buffer-strips Agarose-geler Buffer: Tris-Barbital , pH 8,5 Farveopløsning Applikator-kamme M-komponent

22. Efter migration overføres gel til farve-modul, hvor den farves med: Acid violet eller Amido-Black Eksempel med 15 normale serum-prøver: + Albumin Alfa 1 Alfa 2 Beta 1 Beta 2 gamma Applikation - M-komponent

23. Migrations-mønster: Albumin Alfa 1 Alfa 2 Beta 1 Beta 2 Gamma-globuliner Fibrinogen M-komponent

24. Findes tidl us.? • Vi har en file med CPR-numre for alle patienter, der har/ har haft en M-komponent i blod eller urin. • Hver gang vi har en prøve til M-komponent us. undersøger vi , om patienten er ”kendt ” i vores system. • Hvis ja, finder vi patientens file frem. M-komponent

25. Patientfiles: M-komponent

26. Bedømmelse af elektroforese: • Alle elektroforeser (geler, immunfixationer, kapillærelektroforeser) bedømmes altid af 2 personer: • En bioanalytiker (ofte den, der har udført analysen) • En ” 2. aflæser” – bioanalytiker med denne kompetence, afdelingsbioanalytiker, tilknyttet læge/ kemiker. • For ”kendte patienter” sammenlignes gel/kromatogram med tidl undersøgelser. • Afd.(eller os) kan rekvirere ”lægekommenteret svar”. I så fald skal tilknyttet AC’er bedømme og kommentere M-komponentundersøgelserne. Der udfærdiges et specielt kumuleret svar-skema. M-komponent

27. Bedømmelse af M-komponent. • Vi kommenterer normalt ikke de normale zoner (proteiner) ved en elektroforese. Dog bør bemærkes hvis intet Alfa-1-bånd ses. (Alfa-1-antitrypsin-mangel). • Intet apparatur udtaler sig om M-komponent, det er den subjektive bedømmelse, der ligger til grund for detektion og kvantitering af M-komponent. M-komponent

28. Hyrys:(Scanning og kvantitering af M-komp) M-komponent

29. Scanning i HYRYS (normal serum-prøve’s elektrofærogram) : Albumin Gamma B2 B1 Alfa2 Alfa1 Total-protein-konc. fra Modular Serum-protein) M-komponent

30. Scanning i Hyrys (serumprøve med M-komponent) Integrationsmærker til kvantitering af M-komponent (beliggende i gamma) er sat af bioanalytiker: Resultat: P-M-komponent; massek: 28,5 g/l M-komponent

31. Hvornår mistænkes serum-M-komponent • M-komp kan migrere i: Alfa2,Beta 1 og 2 samt gamma-fraktion • Ekstra bånd? • Dobbelte-bånd? • Unormalt kurveforløb (fx gamma)? • Forhøjet protein-konc.? • Forhøjet konc. af IgA eller IgM evt. IgG.? • Fravær af gamma? • Beta 2 > Beta 1? • ”intuition” Skal altid verificeres ved klasse/type bestemmelse: Immun-fixation (IF). M-komponent

32. Immunfixation (IF) = Klasse/type-bestemmelse på Hydrasys: • Kittet benyttes til detektering af monoklonalt protein (klasse-type bestemmelse). • Kan analysere (1 - 2 )– 4 - 9 prøver ad gangen. • Afdelingen kan normalt ikke rekvirere IF. Ud fra bedømmelse af aktuel prøve, tages stilling til om IF skal udføres. M-komponent

33. Immunfixation: Princip: • Proteiner, som separeres v.h.a. elektroforese på agarose geler, inkuberes med individuelle anti-sera som er specifikt rette mod: • IgG, IgA, IgM, kappa og lambda. (D og E) • Efter fjernelse af de ikke-reagerende proteiner, farves immuno-precipitaterne med acid violet. • De farvede geler evalueres visuelt M-komponent

34. Immunfixation (IF): Albumin Alfa 1 Alfa 2 Beta 1 og Beta 2 gamma Konkl: M-komponent af klasse/type: IgM; kappa beliggende i gamma-regionen. M-komponent

35. Lette kæder alene • Ses ofte ved ”let kæde sygdom” • Vi undersøger altid for IgD og IgE, når en let kæde detekteres ”solo”. (Det er dog uhyre sjældent at IgD og IgE findes) • Lette kæder kan være svære at se på oversigten, hvorfor de ofte kræver IF. M-komponent

36. Hvorfor laver vi ikke IF hver gang ??.Immunofixation er dobbelt så følsom som den alm. elektroforese (”oversigten”) Burde vi også MEN: • Oversigtsanalysen skal altid udføres, da det er herpå M-komponent kvantiteres. • IF kræver en ekstra analysering - og kan kun udføres på få prøver ad gangen ( 4 – 9). • Den er dyr, samt kræver forholdsvis mange bioanalytiker-ressourcer. M-komponent

37. Hvornår benyttes Immunofixation: • Udføres altid ved mistanke om ny M-komponent • Udføres altid hvis en erkendt M-komponent ikke kan ses i ”oversigten” (Fx svag M-komponent, eller M-komponent beliggende i en af de normale bånd) • Udføres altid – og skal verificere- hvis en M-komponent er forsvundet. M-komponent

38. Til Serum M-komponent benytter vi nu: Kapillærelektroforese (CZE): Analyseenhed med 8 kapillærer Reagenser: Buffer Wash Vand og waste Prøve-racks ( 8 primærrør) M-komponent

39. Der analyseres i 8 kapillærer (8 prøver) samtidigt: Migration sker v.h.a Elektro- Osmotisk -Flow (EOF). Princip: Analyse-temp. P-Mkomp : 35 gader C (Peltier-effekt) M-komponent

40. Princip, forts: Aflæsning ved 200 nm ved katode. M-komponent

41. Elektrofærogrammer fra Capillarys 2: 8 prøver er analyseret samtidig i 8 parallelle kapillærer. M-komponent

42. Elektrofærogram fra Capillarys ZOOM-funktion M-komponent

43. Elektrofærogram, Capillarys (minder meget om zone-elektroforese) Albumin α-1 α-2 β-1 β-2 Gamma M-komponent

44. Fraktion Indeholder Bemærk Albumin Albumin, α-lipopriteiner, pre β-lipoproteiner og β-lipoproteiner α-1 Orosomucoid α-1-antitrypsin α-2 2-2 Haptoglobin phenotype og α-2 makroglobulin Er tvedelt ved forekomst af 1-1 Haptoglobin phenotype β-1 Transferrin og Hemopexin β-2 C3-komplement, CRP og C4 Complement Gamma Gammaglobuliner De forskellige zoner indeholder: M-komponent

45. Eksempel på prøve med høj CRP: Bemærk β-2 –fraktion. (normalkurve er lagt oveni og markeret med gult). M-komponent

46. Patient-journaler. • Når vi finder M-komponent hos en patient, oprettes en journal. • Deri sættes patientoplysninger, udklippede geler, IF, udprint fra Kapillærelektroforese, div. andre oplysninger samt kommentarer. • Når patienten efterfølgende skal undersøges for M-komponent i blod/urin fremtages journalen og ligger til grund for bedømmelsen. OBS. Vægt på oprindelig M-komponent. • Vi har ca. 3.500 patient-journaler i arkivet nu. M-komponent

47. Elektrofærogrammer gennemses og bedømmes på Capillarys M-komponent

48. Fordele ved kapillærelektroforese • Der benyttes primær-rør • M.h.t. analyseringen er der mindre ”hands on”, og analysering går hurtigere • Vi synes, elektrofærogrammerne viser flere detaljer (vi detekterer flere M-komponenter her) • Det er nemmere at identificere og kvantitere M-komponent • Mulighed for at lægge patientens tidligere elektrofærogrammer over hinanden (specielt godt når M –komp befinder sig i Alfa2, Beta1 el. Beta 2 zone). • Mulighed for 2-vejs kommunikation med LIS • MEN – bedømmelse af elektrofærogrammer kræver lidt tilvænning. M-komponent

49. Case 1 : IF viste: IgA, Lambda beliggende i Beta1 / beta 2 zone Albumin Kvinde 42 år. Høj IgA Total-protein: 106 g/l M-komp konc: 56,0 Diagnose: Myelomatose. M-komponent

50. Oprindelig M-komponent. Case 1: Gel indsat IF us. (ca, hver 14, dag, M-komponent