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Studio biochimico dell’attivazione dei recettori

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Studio biochimico dell’attivazione dei recettori - PowerPoint PPT Presentation


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Studio biochimico dell’attivazione dei recettori. Le molecole segnale idrofiliche non possono superare il doppio strato lipidico della membrana cellulare. Il sito recettoriale delle molecole idrosolubili è situato sulla parte extracellulare di recettori transmembrana.

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Presentation Transcript
slide1

Studio biochimico dell’attivazione dei recettori

Le molecole segnale idrofiliche non possono superare il doppio strato lipidico della membrana cellulare. Il sito recettoriale delle molecole idrosolubili è situato sulla parte extracellulare di recettori transmembrana.

Molecole segnale lipofiliche attraversano facilmente la membrana cellulare: i loro recettori sono quindi localizzati all'interno della cellula.

slide2

Differenti tipi di recettori

- Legati a canali ionici

- Recettori steroidei

- Recettori legati ad enzimi

- Legati alla proteina G

slide3

Recettori legati a canali ionici con effetto di tipo:

eccitatorioacetilcolina, glutammato, serotonina

(apertura dei canali Na+ con conseguente depolarizzazione)

inibitorioGaba, glicina

(apertura dei canali Cl- con conseguente iperpoplarizzazione)

slide4

Recettori steroidei

Gli steroidi sono molecole con elevata lipofilia, in grado di attraversare le membrane plasmatiche e a livello nucleare legandosi a recettori specifici (DNA-binding protein) regolano la trascrizione di un gene adiacente al legame

slide5

Recettori legati ad enzimi

Quando attivati funzionano direttamente come enzimi (RTK) o sono associati ad enzimi (PTK)

slide6

Recettori legati alla G-protein

Il ligando endogeno (1) lega specificamente il recettore (2). Viene attivato il sistema G-protein (3). Viene attivato l’adenilato ciclasi (4) che produce il secondo messaggero cAMP (5) a partire dall’ATP (6). Avvengono una serie di reazioni enzimatiche (7) e via fosforilazione (8) il glicogeno (9) viene trasformato in glucosio (10). La fosforilazione può interessare proteine di membrana come canali ionici (11).

slide7

Attivazione della Proteine G

La G-protein è composta da tre subunità legata quando non attivata al GDP

L’interazione ligando recettore attiva la

G-protein liberando GDP...

Il GTP legato ad a viene idrolizzato a GDP+ P. Le subunità si ricombinano.

..legando GTP. Il trimero si suddivide

slide8

Gq

R

R

Gi

Gs

R

GTP

ATP

cAMP

GDP

GTP

GDP

GTP

GDP

AC

DAG

PK-C

+

Ca++ RS

PIP2

IP3

+

Ca++

PL-C

+

Ca++

+

PK-A

+

-

slide9

O

H

N

N

O

35S

O

N

O

H

C

H

O

P

O

P

O

P

H

N

N

O

2

2

O

H

O

H

O

H

O

H

O

H

Sfruttando il meccanismo di attivazione illustrato si può determinare l’attività agonista, agonista inverso, agonista parziale, antagonista.

UtilizzandoGTPgS35, analogo non idrolizzabile del GTP, si può misurare l’attività di un ligando in base all’accumulo dia-GTPgS35.

Nel caso in cui il composto sia antagonista è necessario realizzare la curva di attività in presenza di un agonista pieno e verificare lo spostamento parallelo a destra a dosi crescenti di antagonista.

slide10

Agonista pieno

100

Agonista parziale

)

Agonista inverso

35

S

g

Bound

50

(GTP

0

10

-11

10

-10

10

-9

10

-8

10

-7

10

-6

10

-5

log dose

slide11

AP

AP

AP

AP

S

S

S

+S

Dosaggio del secondo messaggero

cAMP

La reazione è basata sulla competizione per l’anti-anticorpo tra cAMP legato alla fosfatasi alcalina e quello libero proveniente dalla stimolazione recettoriale

slide12

AP

cAMP coniugato alla fosfatasi alcalina

Anticorpo primario legato al pozzetto

cAMP indotto dall’attivazione

Anticorpo secondario

recettoriale

del ligando

La quantità di cAMP cellulare è inversamente proporzionale alla quantità di colorazione gialla svolta.

slide13

Attivazione di PK-A

Glucagone

G-Protein

(a, b, g, subunità)

Recettore

G-Protein (a, subunità)

Adenilato ciclasi

(inattivo)

Fosforilazione

di substrati

PK-A

PK-A inattiva

slide14

Substrato PK-A-R110 (bisammide Rhodamina 110 peptide)

PK-A

PK-A R110

non fluorescente fosforilato

PK-A R110

non fluorescente

proteasi

proteasi

Eccitazione 485 nm

Emissione 530 nM

PK-A R110

fluorescente

non fluorescente

slide15

L’intensità di fluorescenza misurata nel saggio è inversamente correlata all’attività della PK-A

100,000

50,000

0

FLU

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

% peptide fosforilato

slide16

Dosaggio del Ca++ intracellulare

IP2

IP3

DAG

Gq-a

Proteina kinasi C inattiva

REL

Proteina kinasi C

Calmodulina-proteina Kinasi (inattivoa)

Calmodulina-proteina Kinasi

slide17

Dosaggio del Ca++

Saggio dell’Aequorina

L’Aequorina è una fotoproteina riscontrata nella medusa Aequorea Victoria.

L’apoaequorina è una proteina di 21 KDalton e necessita di un gruppo prostetico idrofobico coeletranzina per essere convertita nella forma enzimatica attiva: aequorina.

slide18

In presenza di Ca++ aequorina ossida la coeletranzina in coelentramide con produzione di CO2, ed emissione di luce.

Questi saggi vengono effettuati in linee cellulari stabili in grado di esprimere il GPCR ed apo-aequorina

slide19

Sistemi di modulazione del segnale

Oltre a sistemi di attivazione recettoriale e di amplificazione del segnale sono presenti meccanismi di interruzione del segnale

  • Autoregolazione del rilascio del neurotrasmettitore
  • (feedback negativo)

Questo meccanismo si realizza mediante recettori presinaptici che possono essere controllati dallo stesso neurotrasmettitore (autorecettori) o da un neurotrasmettitotre differente (eterorecettori)

slide20

Sistemi enzimatici preposti alla degradazione

  • Sistemi di recupero del neurotrasmettitore
  • Desensitizzazione recettoriale
  • (in recettori accoppiati alla G-protein)

La desensitizzazione può essere:

  • omologa (specifica per un recettore) oppure eterologa (non specifica);
  • rapida (~ 20 minuti) oppure lenta (giorni);
  • perdita funzione recettoriale (uncoupling) o con diminuzione dei recettori (down-regulation)
slide21

Uncoupling del recettore (desensitizzazione rapida)

La fosforilazione non altera la capacità del recettore di attivare la G-protein ma aumenta l’affinità del recettore fosforilato per la proteina b-arrestina che inibisce l’interazione del recettore con la G-protein determinando il disaccoppiamento).

slide22

Uncoupling del recettore (desensitizzazione lenta)

Molti sistemi recettoriali sono fosforilati dai loro stessi enzimi effettori PKA e PKC

Questo tipo di fosforilazione è un feedback diretto negativo che al tempo stesso sopprime l’attivazione dell’enzima effettore PKA.

Questo meccanismo di desensitizzazione è eterologo in quanto l’attivazione di PKA PKC è sufficiente a determinare la fosoforilazione del recettore.

La desensitizzazione da PKA è più lenta ma è molto più sensibile alla concentrazione di agonista.

slide23

Saggi funzionali su organo isolato

In questi esperimenti in seguito ad uno stimolo (farmacologico o elettrico) deve essere apprezzabile e misurabile una risposta in un preparato biologico

L’effetto che si dovrà valutare può essere rappresentato da:

variazione di lunghezza o di tensione del preparato biologico

variazioni del volume del preparato biologico che viene valutato mediante semplici registratori a galleggiante

variazioni di pressione

slide25

La stimolazione del preparato biologico può essere effettuata

Elettricamente

In alcuni esperimenti può essere necessario stimolare elettricamente il preparato. La forma e la durata degli impulsi sono parametri importanti soprattutto in preparati neuromuscolari.

Farmacologicamente

Le concentrazioni di farmaco necessarie in questo tipo di esperimento sono molto basse anche perché quando impiegati a dosaggi elevati sono dotati di vari effetti ed è quindi importante scegliere quelle concentrazioni alle quali agiscono in modo specifico.

slide26

Esperimenti farmacologici

Qualitativi

Quantitativi

Quantizzazione

dell’attività caratterizzata

Studio del meccanismo di azione

Agonisti

producono effetti attivi o diretti sui preparati biologici

Antagonisti

producono effetti negativi o indiretti e inibizione o alterazione degli effetti degli agonisti

slide27

Curva dose-risposta di un agonista pieno

Effetto massimo

Effetto massimo percentuale

Log dose

In rosso la curva dose-risposta dell’agonista.

In nero le curve dose risposta dell’antagonista in presenza di dosi crescenti di antagonista.

slide28

Risposta dell’ileo di cavia ad una dose di carbacolo

dose

dose

carbacolo 1 mM in presenza di 0.1 mM di atropina

carbacolo 1 mM

slide29

Attività pre- post- giunzionale

Impulso elettrico

Contrazione

Agonista pre-

Un agonista pre- è in grado di ridurre il rilascio di mediatore chimico successivo alla stimolazione elettrica.

Es: 8-OH-DPAT sui recettori serotoninergici 5-HT1A nella vescica o ileo di cavia

slide30

Agonista post-

Un agonista post è in grado di attivare autonomamente l’effetto biologico

Es: carbacolo su recettori muscarinici nell’ ileo di cavia