第三节 聚合酶链反应( polymerase chain reaction,PCR ) - PowerPoint PPT Presentation

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第三节 聚合酶链反应( polymerase chain reaction,PCR )

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Presentation Transcript

  1. 第三节 聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR) • PCR是模拟体内DNA复制条件,应用DNA聚合酶反应,特异性扩增某一DNA片段的技术。 • 体外程序化的DNA合成技术。

  2. PCR

  3. 原 理: 1)合成待扩增区域两端已知序列,与模板DNA互补的寡核苷酸特异性引物,引物的序列决定扩增片段的长度; 2)反应体系:DNA模板,dNTP,Taq DNA聚合酶,buffer 3)反应程序:变性94~95oC 复性延伸 37~55 oC 70~72 oC 72 oC延伸10min DNA扩增100万倍

  4. PCR扩增

  5. PCR特点及应用: 特点:(1)特异性强,灵敏度高,稳定可靠,快 速; 2)微量的模板DNA即可扩增大量产物; 应用:(1)基因组DNA分析; (2)遗传物质的鉴定; (3)遗传病的诊断; 缺点:(1)需靶DNA序列的信息; (2)产物短小,DNA复制不精确。

  6. PCR相关技术: 1.增效PCR(booster PCR) 当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到两个问题:一是形成引物二聚体,一是非特异扩增,消耗了引物和酶,而特异扩增片段产量降低。对于这种情况,可设置二步PCR,先用较低浓度的引物进行初级PCR,此时由于引物少,形成引物二聚体的可能减少,但它并不影响靶序列的扩增,只是由于引物少产量不高。约经15~20个循环后补充产物量,以初级PCR产物为模板进行扩增,靶序列的产量将相应增加。

  7. 2. 巢式PCR(nest PCR)    此时也是进行二步PCR,与上面不同的是,第二级PCR需另行设置反应体系,并应用另外的PCR引物,此时引物的位置位于初级PCR引物的内侧,用初级PCR产物做模板,进行第二步PCR,这样只有初级PCR中特异的扩增片段才能被二级引物扩增。    除了达到增效PCR同样的目的外,还提高了最终产物的特异性。

  8. 3、多重PCR • 在同一PCR体系中加入数对PCR引物,如果这些引物的退火温度相近,并且所覆盖的区域不重叠,这样的反应体系可同时扩增多个DNA片段。 • 多重PCR常用来检测同一基因的多个外显子的缺失,或在检测缺失设置内对照。

  9. 4.RT-PCR • RT-PCR是以mRNA为模板,经逆转录酶作用合成cDNA。使微量的mRNA(pg水平)迅速扩增(达ng~ug水平),大大提高mRNA的检出灵敏度。应用于基因表达与调控的研究。

  10. RT-PCR

  11. RT-PCR cDNA

  12. 五、单链构象多态性(Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP) •  是指单链DNA由于碱基序列不同可引起构象差异,这种差异将造成相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率不同。据此,可用于DNA中单个碱基的替代,微小的缺失或插入的检测。 通常与PCR技术联合应用,称为PCR-SSCP技术。 • 在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物,进行PCR扩增,其产物经甲酰胺等变性,并在聚丙烯酰胺凝胶中电泳(中性胶),突变所引起的DNA构象差异将表现为电泳带位置的差异,从而作出判断。

  13. PCR-SSCP过程: 原 理 过 程 DAN --------------------------- primer --------------------------- ↓ 32P-dNTP掺入PCR扩增 产物 ↓ 变性 ↓ 单链DNA ↓ 中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ↓ 1 2 3 4 5 自显影 ↓ 1.为正常 结果分析 2、4、5纯合患者 3.为杂合子 . 解链 构像

  14. 第二节DNA多态 • DNA多态(DNA Polymorphism): • 群体中每个个体(体细胞)的两套单倍体DNA是不完全相同的,一般每100~500bp就有一个是不相同的,它们多位于内含子序列中,表型并没有改变,这种表现称为DNA多态。常用做遗传分析中的标记。 • 除一卵双生子外,没有两个个体的基因组DNA是完全相同的。

  15. DNA分析中常用的多态性标记有3类: 1)RFLP:称限制性片段长度多态性,为第一代多态性标记; 2)重复序列多态性:短串联重复序列(STR),为第二代多态性标记; 3)单碱基多态性(SNP):DNA序列的单个核苷酸的差别,为第三代多态性标记。

  16. 一、序列多态(或点多态) •   限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism ,RFLP )。 •   由于碱基的变异可能倒致限制酶切点的消失或新的酶切点出现,从而引起不同个体的DNA在用同一限制酶切割时,产生DNA片段长度的差异。这种由于酶切位点变化导致的DNA片段长度的差异称为RFLP。 • RFLP按孟德尔(共显性)方式遗传,是非常有用的遗传标记。

  17. Allele II 产生了新的酶切点 12Kb Allele I 12Kb 8Kb 4Kb 8Kb Allele II probe RFLP—Southern blot检测结果

  18. AlleleII酶切位点消失

  19. 二、序列长度多态性(或数目变异串联重复,variable number tendom repeats, VNTR) • 重复序列以各自的核心序列(重复单元),首尾相连多次重复,称为串联重复序列。散在地分布于染色体上,以插入/缺失方式形成多态。如图: • VNTR两侧的酶切位点固定,但两酶切点之间的串联重复拷贝数不同,酶切后产生不同长度的片段。

  20. VNTR 酶切,电泳后的检测结果 大 小

  21. PCR-VNTR检测

  22. 通常,重复单位16~28bp长,称为小卫星DNA。 重复单位2~6bp长,如(TA)n, (CGG)n等,称为微卫星DNA。DNA多态可以通过PCR扩增后电泳来检出,称扩增片段长度多态(amplified fragment length polymorphism, Amp-FLP)

  23. PCR-VNTR

  24. 生物芯片技术 • 九十年代以来,发展了一种新的分子生物学技术,引起了人们的极大关注。生物芯片,实际上是一种微型多参数生物传感器。它通过在一微小的固体载体表面固定大量的分子识别探针,构建一组微分析单元和系统,以实现对化合物,蛋白质,核酸,细胞或其他生物组分准确,快速,大量的筛选或检测。 • 基因芯片(又称DNA芯片,生物芯片,DNA探针微列阵),它集成了大量的密集排列的基因探针,通过与被检测基因的碱基序列进行互补配对,实现核酸序列的分子识别。能在同一时间内分析大量的基因,实现生物基因信息的大规模检测。

  25. 基因芯片 如:  靶基因   基因组 特异性片段 探 针 ----AGCTTAGC---- 靶序列 ----TCGAATCG---- probe A B C 检测 1 2 3 4 5

  26. 基因芯片的应用:  一、基因组扫描  二、寻找基因功能  三、基因型及单碱基多态(SNP)  四、突变检测  五、基因表达