Proizvodnja enzima mikrobnog podrijetla

1. Proizvodnja enzima mikrobnog podrijetla Irena Fabijančić 505/ PI Jelena Katanović 515/ PI Goran Strganac 522/PI

2. Izvori za proizvodnju enzima • 1. Mikroorganizmi (brža i efikasnija proizvodnja, visoka koncentracija enzima, strogo definirani uvjeti) • 2. Biljke (cijele ili ostatci) • Slad (amilaze, proteaze) • Ananas (bromelin) • 3. Životinjski organi i tkiva • Teleći želuci (renin) • Goveđi ili svinjski pankreas (tripsin, kimotripsin) • Goveđi ili svinjski želuci (pepsin) • Krijesnica (luciferaza)

3. Podjela enzima prema mjestu djelovanja • 1. Intracelularni-djeluju unutar stanice i čine veliku većinu poznatih enzima • 2. Ekstracelularni-djeluju izvan stanice ( izlučuju se u okolinu za pripravu hranjiva za ulazak u stanicu)

4. Tehnološki proces proizvodnje enzima • 3 stupnja • 1. priprema inokuluma • 2. kultivacija proizvodnog mo, tj. biosinteza enzima • 3. izolacija enzima iz kulture mo (čisti ili tehnički enzimski preparat)

5. 1.PRIPREMA INOKULUMA • Mikroorganizam mora: • Biti visoke produktivnosti • Stabilnih fizioloških karakteristika • Jednostavnih uvjeta kultivacije • Priređena biomasa inokuluma treba biti definirane fiziološke aktivnosti u log fazi rasta te u dovoljnoj koncentaciji • Standardna konc. je 5-10% volumena podloge u fermentoru

6. Faktori koji utječu na biosintezu enzima • mo producent • sastav hranjive podloge • uvjeti kultivacije – aeracija, temperatura, pH, stadij ciklusa rasta • regulacijski mehanizmi – indukcija, represija, doziranje gena • MO PRODUCENT : visoko produktivni sojevi industrijskih i radnih mo se dobivaju selekcijom, mutacijama, genetičkim inženjeringom te optimiranjem uvjeta kultivacije

7. MIKROORGANIZAM MORA BITI: • visoko produktivan, nepatogen, ne smije prozvoditi toksine, fiziološki i genetički stabilan, zadovoljavajuća brzina rasta • Najčešči proizvođači enzima: • Bakterije: Bacillus (amilaze, proteaze, lipaze) • Plijesni: • Aspergillus ( amilaze, proteaze, pektinaze) • Penicillium (penicilinski antibiotici) • Rhizopus (glukoamilaze) • Aktinomiceti: Streptomyces (proteaze) • Kvasci: Saccharomyces (invertaze)

8. 2.KULTIVACIJA PROIZVODNOG MO • SASTAV HRANJIVE PODLOGE treba omogućiti dobar rast mo i visok prinos enzima • SASTAV PODLOGE ovisi o: • mo • fiziološkim svojstvima • načinu kultivacije • enzimu koji proizvodimo • HRANJIVA PODLOGA SADRŽI • Izvor ugljika • Izvor dušika • Mineralne elemente i mikroelemente • Stimulatore sinteze enzima

9. UVJETI KULTIVACIJE • A) Aeracija-proizvodnja ind.važnih mo aeroban proces. Aeracija mora osigurati dovoljnu količinu otopljenog kisika da ne ograničava rast ili biosintezu enzima • B) Temperatura-optimalna temp biosinteze enzima s plijesnima je 22-32 °C; bakterije su termofilne 35-55 °C. Termofilni pogodniji jer je lakše odvođenje topline tijekom procesa i rijeđe su kontaminacije • C) pH za plijesni 4,5-7,5 a bakterija 6,5-7,5 • D) Stadij ciklusa rasta – u proizvodnji enzima vrijeme kultiviranja je određeno biosintezomn enzima a ne rastom mo; različiti mo proizvode enzime u različitim fazama rasta kulture

10. 3. IZOLACIJA I PROČIŠĆAVANJE ENZIMA

11. Prvi stupanj u izolaciji je razbijanje stanica kemijskim (osmotski šok, djelovanje enzima, otapanje, otapanje lipida, djelovanje alkalijama) ili mehaničkim metodama (homogenziacija, drobljenje, uz mljevenje u kugličnom mlinu) • Zatim uklanjanje nukleinskih kiselina koje ometaju izolaciju enzima zbog povećane viskoznosti • Sam enzim se uklanja: • filtracijom, centrifugiranjem, dekantiranjem, koagulacijom i flokulacijom

12. Razlike tehničkih i čistih pripravaka kod izolacije • U prehrambenoj se industriji uglavnom koriste “slobodni enzimi” tehničke čistoće i s teško definiranim djelovanjem (okus, miris, izgled, stupanj konverzije u namirnicama) koje utječe na vrijeme i uvjete procesa prerade proizvoda • Imobilizirani enzimi (čisti pripravci) se uglavnom koriste u kemijskoj i farmaceutskoj industriji (skraćenje dugih kemijskih reakcija, razdvajanje i pročišćavanje smjese izomera i sl.) • Glavna razlika: tehnički se proizvode u velikim količinama i imaju nisku cijenu dok čisti dolaze u malim količinama i imaju znatno višu cijenu

13. Tehnike Kultiviranja mikroorganizama • 1. Površinski ili emerzno (rast na površini tekuće podloge ili rast na površini čvrstih nosača) • Prednosti: jednostavna i jeftina oprema, • Nedostatci: djelomična aseptičnost, niska brzina otapanja kisika • 2. Dubinski ili submerzno (rast u hranjivoj podlozi koja se miješa i/ili aerira) • Prednosti: Homogena distribucija mikrobnih stanica u hranjivoj podlozi Homogena distribucija mjehurića zraka (aerobni procesi) u hranjivoj podlozi, velika dodirna površina i velika brzina otapanja kisika Mikroorganizmi brzo rastu i sintetiziraju produkt Najveći stupanj iskorištenja supstrata i produktivnost

14. Primjer reaktora za površinsku proizvodnju celulaze – aeracija zrakom, supstrat je u plitkim tavama

15. UPORABA ENZIMA U PREH.INDUSTRIJI • Enzimi u voćnim sokovima: • Problemi u pripravi voćnih sokova : zamućenja uzrokovana pektinima • Komercijalni pektolitički enzimi su singergistička smjesa enzima: • Poligalaktouronaza hidroolizira bez određenog reda 1,4 alfa D galakturonsku vezu • Pektinesteraza oslobađa metanol iz pektil metil estera • Pektin lijaza cijepa pektin uz oslobađanje oligosaharida • Hemicelulaza cijepa hemicelulaze i pomaže djelovanju pektinaza • Enzimi djeluju na pH 4-5 ispod 50 C i dodaju se direktno u voćnu pulpu

16. Još u industriji: • Upotreba proteaza – renin iz četvrtog želuca teladi-primjena u pripravi sira, omekšavanju mesa, postizanju okusa u namirnicama-hidrolizira peptidnu vezu između fenilalaninskog i metioninskog ostatka • U proizvodnji šećera – invertaze i rafinaze, dekstranaze i alfa amilaze • U pivarstvu : dekstrini (daju punoću pivu i stabiliziraju pjenu), celulaze, papain (upotrebljava se u postfermentacijskom stupnju da bi se spriječilo pojavljivanje mutnoće ili taloga), glukoamilaza, fungalna alfa amilaza

17. Enzimi u pekarstvu • Najčešće se koristi fungalna α-amilaza ili Taka-amilaza koje proizvodi Aspergilus Oryzae • Degradiraju oštećene granule škroba • Oslobađaju maltozu koju kvasci koriste kao izvor ugljika • Reduciraju viskoznost tijesta • Ostali enzimi :ksilanaze (reduciraju probleme vezane uz neujednačenost kvalitete brašna), oksidoreduktaze (utječu na volumen i teksturu proizvoda), lipaze (smanjuju čvrstoću kore), proteaze (povećavaju sposobnost ekspanzije glutenskog matriksa)

18. UPORABA ENZIMA U DETERGENTIMA • 60% svih detergenata imaju enzime • Općenito detergenti s enzimom uklanjaju proteine s odjeće, mrlje od krvi, mlijeka, masti i voća puno efikasnije nego detergenti bez enzima • Najčešće se koriste proteaza i amilaza, a djelomično lipaza i celulaza • Svi enzimi koji se koriste moraju biti aktivni pri pH između 8 i 10,5 i temperaturi do 60⁰ • u detergentima za suđe koriste se amilaze, proteaze i lipaze

19. ENZIMI ZA RAZGRADNJU ŠKROBA • α-amilaza je endohidrolaza i cijepa α-1,4 vezu bez određenog reda • β-amilaza je egzohidrolaza koja cijepa samo α-1,4 vezu i daje kao glavni produkt maltozu • Još neki od važnijih enzima za razgradnju škroba su glukoamilaza i pululanaza

20. ENZIMI ZA RAZGRADNJU CELULOZE • Celulaza-enzim koji razgrađuje celulozu na monosaharidne (glukoza) i disaharidne (celobioza) jedinice • Uklanjaju celulozna vlakna oštećena pranjem i nošenjem, a pri tome ne oštećuju glavna celulozna vlakna

21. MEDICINSKA PRIMJENA ENZIMA • Glavne primjene enzima u medicini su uglavnom povezane s uklanjanjem toksičnih tvari • Još u 19. stoljeću upotrebljavali su se pankreasni enzimi za uklanjanje probavnih smetnji • Danas se još primjenjuju: • Asparaginaza- u liječenju leukemije • Lizozim- kao antibiotik • Rodonaza- spriječava trovanje cijanidom • Ribonukleaza- antivirusno djelovanje • Tripsin- protuupalno djelovanje