1 / 21

Izolovanje i pre čišćavanje enzima

Izolovanje i pre čišćavanje enzima. Zašto izolujemo enzime? Strategija prečišćavanja - maksimalna prečišćenost - maksimalni prinos - maksimalno sačuvana aktivnost Izvor enzima - obilnost - dostupnost (ekonomska, geografska, etička) - komparativne studije (izoenzimi)

rosina
Download Presentation

Izolovanje i pre čišćavanje enzima

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Izolovanje i prečišćavanje enzima

  2. Zašto izolujemo enzime? • Strategija prečišćavanja - maksimalna prečišćenost - maksimalni prinos - maksimalno sačuvana aktivnost Izvor enzima - obilnost - dostupnost (ekonomska, geografska, etička) - komparativne studije (izoenzimi) - lokalizacija Ekstrakt (homogenizacija, ili prečišćavanje organela + homogenizacija) Sirovi preparat (large-scale separacija) Čist enzim (small-scale separacija, ili afinitetna hromatografija direktno iz ekstrakta)

  3. Faze u izolovanju • Zahtevi za čistoćom se definišu prema konačnoj upotrebi preparata 1. vrlo visoka (99 % i više) terapeutska primena, in vivo studije 2. umereno visoka (95-99 %) x-ray kristalografija, karakterizacija fiziko- hemijskim metodama 3. umerena izolovanje antigena za proizvodnju antitela, N-terminalno sekvenciranje • Identifikujte ključne nečistoće • Proverite stabilnost enzima (pH, jonska sila) i u skladu sa tim osmislite strategiju izolovanja i prečišćavanja • Ukoliko niste zadovoljni čistoćom preparata, uključite nove korake • Kontaminante koji mogu da inaktiviraju enzim, ili ga denaturišu, potrebno je ukloniti (ili inaktivirati npr. proteaze) što ranije iz smeše (najbolje već u prvom koraku).

  4. Osobine proteina koje se koriste tokom prečišćavanja • Naelektrisanje Jonoizmenjivačka hromatografija (IEX) • Veličina Gel filtracija (GF) • Hidrofobnost Hidrofobna hromatografija (HIC), RPC • Bioprepoznavanje Afinitetna hromatografija

  5. Enzimi dobijeni rekombinantnom tehnologijom • Neke proteine je izuzetno teško izolovati iz prirodnih izvora • Gen (cDNA) manipulacijom DNK se ubacuje u odgovarajući vektor • Vektor se ubacuje u odgovarajući sistem za ekspresiju (proizvodnju): bakterijski, biljni, insektni, sisarski. • Manipulacijom na nivou cDNA, rekombinantni protein može da dobije ekstra aminokiseline, ili čitave proteine (GST), u vidu fuzionog produkta, koji ne utiču na aktivnost, ili 3D, ali mogu da olakšaju postupak izolovanja (His tag). • Koliko je protein dobijen rekombinantnom tehnologijom sličan (identičan) prirodnom proteinu? • Karakterizacija... • Primena...

  6. Primer postupka prečišćavanja rekombinantnog enzima Deacetoksicefalosporin C sintetaza (rDAOCS) je enzim osetljiv na kiseonik. Protein je “overexpressed” u rastvornoj formi u citoplazmi E. coli. U prvom koraku, ćelije su lizirane mehaničkom silom. Pufer za lizu je sadržavao inhibitore proteaza, pored ostalih komponenti (DTT).

  7. Odredjivanje molekulske mase GF i SDS PAGE

  8. Odredjivanje strukture rDAOCS

  9. Afinitetetna hromatografija • Enzim – analog supstrata, inhibitor, kofaktor • Antitelo – antigen, virus, ćelija • Lektin – polisaharid, glikoprotein, receptor na površini ćelija, ćelija • Nukleinska kiselina – komplementarni lanac, histoni, NK polimeraze, NK vezujući proteini • Hormoni, vitamini – receptor, transportni protein (nosač) • Glutation – Glutation-S-transferaza ili GST fuzioni proteini • Joni metala – Poli(His) fuzionisani proteini, proteini bogati His, Cys, Trp ostacima na površini

  10. Prečišćavanje enzima: onovni problemi i postavke -         Neophodan je odgovarajući test enzimske aktivnosti -         Odgovarajući test za odredjivanje koncentracije proteina -         Definicije: specifična aktivnost, prinos, stepen prečišćenja, broj izmena -         Dnevnik postupka izolovanja i prečišćavanja (zapremina, conc., akt.) -         Izbegavati one korake koji daju slab prinos i mali porast u čistoći Neke osnovne definicije: • Jedinica aktivnosti (1 U): Ona količina enzima neophodna za katalizu reakcije transformacije 1 mikromola supstrata po minuti pri standardnim uslovima*. • 1 Katal – 1 mol supstrata u 1 s Primer: Ako 0,1 mg/mL enzima katalizuje konverziju 10 mikromola substrata po minutu, tada u 1 mL ima 10 jedinica aktivnosti.Specifična aktivnost ovog rastvora će biti 100 U/mg proteina. *Standardni uslovi: oni koji odgovaraju datom enzimu (pufer, prisustvo kofaktora etc). Odnosno, kad god je moguće: -         Temperatura 30 oC -         pH optimum za dati sistem Enz-Sub Koncentracija substrata na 10x poluzasićenja substratom (10 Km) Brzina: promena koncentracije reaktanata u vremenu. Reakciona brzina koja se odredjuje u kinetičkim eksperimentima odgovara početnoj brzini reakcije (vi, vo). Sprečava se efekat povratne reakcije, inhibicija proizvodom se svodi na minimum.

  11. - Poluzasićenje -         Brzina enzimske reakcije postiže zasićenje kada je koncentracija substrata toliko visoka da su sva aktivna mesta zauzeta (maksimalna brzina – Vmax). -         Poluzasićenje enzima substratom je ona konc. substrata kada se postiže 50 % Vmax (Km – merilo afiniteta enzima za odgovarajući substrat) Poznavanje vrednosti Km za dati sistem je moguće ukoliko se poznaje Vmax ili nakon serije eksperimenata za odredjivanje brzine za različite konc. substrata i »fitovanja« tih podataka u jednačinu koja opisuje oblik ove krive prema nepoznatim vrendostima (Km i Vmax). Koju jednačinu koristiti... Nekoliko hemijskih kinetičkih modela daje slične jednačine oblika: Y = aX/(b+X)

  12. Analitika proteina Elektroforetske tehnike -         Nativna elektroforeza -         Elektroforeza u prisustvu uree -         SDS PAGE -         Gradijentni gelovi -         Izoelektrofokusiranje -         Dvodimenzionalne elektroforeze -         Kapilarna elektroforeza Detekcija nakon elektroforetskog razdvajanja -         Proteini (CBB, Ag) -         Glikoproteini (Šifovo bojenje) -         Antigeni (uz odgovarajuće antitelo, najčešće nakon transfera na membranu – imunoblot) -         Enzimi: kao i nakon hromatografskih razdvajanja, uglavnom podrazumeva nativne uslove tj. tehnike separacije koje zadržavaju korektnu tercijernu strukturu proteina/enzima SDS PAGE proteina ekstrakta ploda kivija (levo neredukujući uslovi, desno redukujući)

  13. Detekcija enzimske aktivnosti nakon elektroforetskog razdvajanja -         Sa solubilnim supstratom – podrazumeva prethodnu eluciju proteina iz gela (zametna i neprecizna tehnika) -         Sa precipitirajućim supstratom koji daje proizvod koji se može detektovati (u gelu ili na membrani) – enzim nativan ili renaturisan Tehnika zimograma (za proteolitičke enzime) Aktininidin razvojen 2D PAGE i detektovan tehnikom zimograma Aktinidin detektovan bojenjem CBB-om, nakon 2D PAGE u različitim uzorcima ekstrakta ploda kivija.

More Related