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  1. Dalla sequenza alla struttura

  2. Dalla sequenza alla struttura VLSEGEWQLVLV . . . O2 SequenzaStrutturaFunzione

  3. Che informazioni offre la struttura? • Conformazione dei siti attivi e di legame • Orientazione dei residui conservati • Interpretazione di meccanismi • Visualizzazione di cavità • Calcolo di potenziale elettrostatico • …

  4. Esempio • FtsZ – divisione cellulare in procarioti, mitocondri e cloroplasti. • Tubulina – componente strutturale dei microtubuli – comunicazione intracellulare e divisione cellulare. • FtsZ e Tubulina hanno bassa similarità di sequenza e non sembrerebbero omologhe.

  5. FtsZ e tubulina sono omologhe? • Proteine che hanno conservato la struttura tridimensionale possono derivare da un progenitore comune anche se la divergenza della sequenza non permette più di riconoscere l’omologia.

  6. Burns, R., Nature 391:121-123 Picture from E. Nogales

  7. Un altro esempio • α-lattalbumina e lisozima possiedono: • Stesso fold • Moderata similarità • Diversa funzione

  8. ALA PRO TRP

  9. Esempi di folding: up-and-down barrel greek key jelly-roll

  10. Domìni

  11. Struttura quaternaria

  12. Cristallografia a raggi X • Ottenere cristalli della proteina • 0.3-1.0 mm • Le singole molecole sono ordinate in modo periodico, ripetitivo. • La struttura è determinata dai dati di diffrazione.

  13. Diffrazione a raggi X

  14. Image from http://www-structure.llnl.gov/Xray/101index.html

  15. Schmid, M. Trends in Microbiology, 10:s27-s31.

  16. Cristallografia a raggi X • Le proteine devono cristallizzare • Grande quantità • Solubili • Accesso a radiazione adatta • Tempo di calcolo per risolvere la struttura

  17. Instrumentation or synchrotron X-rays

  18. Instrumentation ESRF - Grenoble

  19. Instrumentation Elettra - Trieste

  20. Dalla densità elettronica al modello strutturale + = Densità iniziale Interpretazione Struttura 3D • La qualitá delle MAPPE dipende dalla risoluzione. • • La risoluzione dipende dalla qualitá dei cristalli.

  21. Risoluzione

  22. NMR Campo magnetico NOE (Nuclear Overhauser Effect)

  23. Il campo magnetico Magnete a 400 MHz Magnete a 900 MHz Costo commerciale di uno spettrometro a 900 MHz: ca. 5 M € n. di spettrometri 900 MHz operativi al mondo < 10

  24. Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) • Proteine in soluzione • Limite di dimensione ~ 40 kDa • Proteine stabili a lungo • Marcatura con 15N, 13C, 2H. • Strumentazione molto costosa • Tempo per assegnare le risonanze

  25. Regions of the 1H NMR Spectrumare Further Dispersed by the 3D Fold What would the unfolded protein look like?

  26. Resolve Peaks By Multi-D NMR A BONUSregions in 2D spectra provide protein fingerprints If 2D cross peaks overlap go to 3D or 4D …..

  27. C N Conformational Ensemble Representing an NMR Structure

  28. X-ray Richiede cristalli, problematico Non ha limiti (teorici) di grandezza Piú preciso Risoluzione Struttura può essere deformata dai cristalli, rigida Una “soluzione“ NMR Possibile in soluzione, più semplice Limitato a proteine fino a circa 300 residui Meno preciso Numero di vincoli Struttura nativa in soluzione, flessibile Molti modelli Pro e contro

  29. X-ray NMR

  30. Protein Data Bank (PDB) • URL: http://www.rcsb.org/pdb/ • Coordinate 3-D di strutture proteiche • Formato unico • Tutte le strutture risolte con i raggi X e NMR • Più vecchia della maggior parte degli altri database • Strutturata male a causa dello sviluppo storico

  31. Il Protein Data Bank

  32. Crescita del PDB

  33. Motivi strutturali depositati ogni anno

  34. Superfamiglie depositate ogni anno

  35. Formato PDB I HEADER ONCOGENE PROTEIN 06-JUN-91 121P 121P 2 COMPND H-RAS P21 PROTEIN COMPLEX WITH GUANOSINE-5'-[B,G-METHYLENE] 121P 3 COMPND 2 TRIPHOSPHATE 121P 4 SOURCE HUMAN (HOMO SAPIENS) CELLULAR HARVEY-RAS GENE TRUNCATED AND 121P 5 SOURCE 2 EXPRESSED IN (ESCHERICHIA COLI) 121P 6 AUTHOR U.KRENGEL,K.SCHEFFZEK,A.SCHERER,W.KABSCH,A.WITTINGHOFER, 121P 7 AUTHOR 2 E.F.PAI 121P 8 ... REMARK 1 121P 17 REMARK 1 REFERENCE 1 121P 18 REMARK 1 AUTH U.KRENGEL,I.SCHLICHTING,A.SCHEIDIG,M.FRECH,J.JOHN, 121P 19 REMARK 1 AUTH 2 A.LAUTWEIN,F.WITTINGHOFER,W.KABSCH,E.F.PAI 121P 20 REMARK 1 TITL THE THREE-DIMENSIONAL STRUCTURE OF P21 IN THE 121P 21 REMARK 1 TITL 2 CATALYTICALLY ACTIVE CONFORMATION AND ANALYSIS OF 121P 22 REMARK 1 TITL 3 ONCOGENIC MUTANTS 121P 23 REMARK 1 REF NATO ASI SER.,SER.A V. 220 183 1991 121P 24 REMARK 1 REFN ASTM NALSDJ US ISSN 0161-0449 2002 121P 25 ... SEQRES 1 166 MET THR GLU TYR LYS LEU VAL VAL VAL GLY ALA GLY GLY 121P 56 SEQRES 2 166 VAL GLY LYS SER ALA LEU THR ILE GLN LEU ILE GLN ASN 121P 57 SEQRES 3 166 HIS PHE VAL ASP GLU TYR ASP PRO THR ILE GLU ASP SER 121P 58 ...

  36. Formato PDB II HELIX 1 A1 LYS 16 GLN 25 1 121P 80 HELIX 2 A2 SER 65 THR 74 1 121P 81 ... SHEET 1 S 6 GLU 37 ILE 46 0 121P 85 SHEET 2 S 6 GLU 49 THR 58 -1 O LEU 53 N LYS 42 121P 86 SHEET 3 S 6 THR 2 VAL 9 1 N LEU 6 O ASP 54 121P 87 ... TURN 1 T1 ALA 11 VAL 14 121P 91 TURN 2 T2 ILE 46 GLU 49 121P 92 TURN 3 T3 ALA 83 ASN 86 121P 93 ... ATOM 1 N MET 1 -7.176 32.630 -6.655 1.00 14.06 121P 104 ATOM 2 CA MET 1 -5.913 31.928 -6.676 1.00 17.27 121P 105 ATOM 3 C MET 1 -5.903 30.860 -5.600 1.00 16.41 121P 106 ATOM 4 O MET 1 -6.703 30.881 -4.654 1.00 16.12 121P 107 ATOM 5 CB MET 1 -4.712 32.869 -6.415 1.00 17.94 121P 108 ATOM 6 CG MET 1 -4.594 33.420 -4.990 1.00 19.41 121P 109 ATOM 7 SD MET 1 -3.193 34.558 -4.899 1.00 21.82 121P 110 ATOM 8 CE MET 1 -4.325 35.886 -4.618 1.00 23.68 121P 111 ATOM 9 N THR 2 -4.966 29.934 -5.760 1.00 15.08 121P 112 ATOM 10 CA THR 2 -4.759 28.930 -4.751 1.00 16.71 121P 113 ATOM 11 C THR 2 -4.312 29.597 -3.441 1.00 16.63 121P 114 ... HETATM 1324 PG GTO 167 5.150 32.173 22.030 1.00 11.69 121P1427 HETATM 1325 O1G GTO 167 4.768 32.597 23.390 1.00 13.29 121P1428 HETATM 1326 O2G GTO 167 4.164 32.683 21.069 1.00 12.61 121P1429 HETATM 1327 O3G GTO 167 4.834 30.641 22.025 1.00 13.18 121P1430 ... X Y Z B-factor

  37. ATOM 1 CA GLU 225 -0.900 -1.002 39.233 1.00 70.00 1HXN 170 ATOM 2 C GLU 225 -0.185 0.146 39.970 1.00 70.00 1HXN 171 ATOM 3 O GLU 225 -0.514 1.329 39.758 1.00 70.00 1HXN 172 ATOM 4 N SER 226 0.788 -0.203 40.823 1.00 70.00 1HXN 173 ATOM 5 CA SER 226 1.534 0.805 41.594 1.00 70.00 1HXN 174 ATOM 6 C SER 226 2.231 1.806 40.681 1.00 68.89 1HXN 175 ATOM 7 O SER 226 1.883 1.952 39.514 1.00 70.00 1HXN 176 ATOM 8 CB SER 226 2.572 0.130 42.515 1.00 70.00 1HXN 177 ATOM 9 OG SER 226 3.237 -0.941 41.848 1.00 70.00 1HXN 178 ATOM 10 N THR 227 3.242 2.478 41.223 1.00 65.51 1HXN 179 ATOM 11 CA THR 227 3.989 3.417 40.410 1.00 70.00 1HXN 180 ATOM 12 C THR 227 4.274 2.705 39.080 1.00 56.25 1HXN 181 ATOM 13 O THR 227 4.179 3.296 38.022 1.00 44.63 1HXN 182 ATOM 14 CB THR 227 5.354 3.797 41.074 1.00 70.00 1HXN 183 ATOM 15 OG1 THR 227 5.114 4.682 42.172 1.00 70.00 1HXN 184 ATOM 16 CG2 THR 227 6.256 4.492 40.065 1.00 70.00 1HXN 185