Transferencia de material genético

1. Transferencia de material genético Inducción de proteína recombinante Álvarez Herrera Marcelino Casas Ventura Rocio Coyol Campos Ana Paulina Pérez Jiménez Aideé Guadalupe

2. OBJETIVOS • Conocer el fundamento de la inducción de la síntesis de proteínas recombinantes de E. coli • Realizar la inducción de una proteína recombinante (β-lactamasa) • Obtener la curva temporal de inducción de una proteína recombinante • Conocer las aplicaciones biotecnológicas de las proteínas recombinantes

3. Inducción de proteínas recombinantes • Las proteínas recombinantes son aquellas que obtenemos a partir de una especie o una línea celular distinta a la célula original. • La proteína se obtiene por la expresión de un gen clonado en esa línea celular que nos interesa. ventajas de expresar proteínas recombinantes en bacterias: fácil de cultivar fácil de modificar genéticamente trabajo rápido alto rendimiento 80%

4. Utilización de sistemas bacterianos

5. Vectores de expresión proteica • Vector de clonación: Sistema que permite introducir en una célula hospedera el fragmento de ADN que se pretende clonar; en esta célula hospedera el vector se replica y se expresa. • Vector de expresión: Tiene mucho de los atributos que un vector de clonación, como el origen de replicación, un sitio de clonación múltiple y por lo menos un marcador seleccionable.

6. Vectores de expresión proteica Vectores de expresión proteica • Además debe ser capaz de ser transcrito por la maquinaria genética dentro de la cual se transforma. • Debe tener un promotor para la ARN polimerasa y el ARN transcrito debe de tener un sitio de enlace ribosomal para que pueda ser traducido. • Debe de tener una secuencia de terminación de la transcripción; de lo contrario, todo el plásmido será transcrito en vez de solamente el gen insertado.

7. Vector pET

8. Sistemas pET • Plásmidos son clonados bajo las señales de expresión fuerte del promotor del bacteriofago T7, quien controla la alta expresión de la RNA polimerasa T7. • Cuentan con una copia del gen cromosomal de la RNA polimerasa T7 bajo el control • Todo bajo el control de un sistema que semeja al operón lac

9. operón lac Centro de control La secuencia del operador Al unirse la proteína represora a la secuencia operadora se inhibe la transcripción

10. Expresión de la RNA polimerasa T7 • La RNA polimerasa lleva a cabo la transcripción del gen de interés, siempre y cuando el operador no este impidiendo su unión a la secuencia promotora del gen. • Para lograrlo se tiene que introducir lactosa o un análogo de ésta, el más utilizado es el isopropil β-D tiogalactosido (IPTG), análogo no hidrolizable que sirve como inductor artificial del operón de la lactosa

11. Como funciona el IPTG en la expresión de proteínas por el operon lac Lac I codifica para una proteína represora

12. Proteína represora IPTG Proteína represora La proteína represora entonces se une al IPTG y o a la secuencia operadora, esto permite la transcripción del gen

13. INDUCCIÓN: • El efecto del IPTG de liberar de la represión del gen, por lo que el IPTG es llamado inductor. • El gen que codifica para la proteína represora se encuentra incluido en el vector, LacI, y su transcripción ocurre a la par que todos los genes incluidos en el vector. Así a pocas horas de inducción, la formación de la proteína deseada, puede llegar a ser más del 50% de la proteína total en la célula.

14. EL VECTOR PET TIENE LA SECUENCIA DENOMINADA OPERADOR EN LA QUE OCURRE LA UNIÓN DE LA PROTEÍNA OPERADORA. LO QUE POR IMPEDIMENTO ESTÉRICO NO PERMITE LA UNIÓN DE LA POLIMERASA T7 Y ENTONCES NO SE TRANSCRIBE EL GEN

15. Experimento • Medio saturado • Inocular una alícuota en medio nuevo • Alcanzar la absorbancia en donde las células se encuentren en la fase log • Añadir el inductor • Tomar alicuotas (curso temporal de indución de proteína recombinante • Separación y visualización en un gel de poliacrilamida-SDS • Determinación del tiempo óptimo de inducción