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PCR Restriction Analysis

PCR Restriction Analysis. Il principio. hsp65 : gene altamente conservato Digestione con un enzima di restrizione specifico per una sequenza nucleotidica non molto frequente Determinazione del pattern dei frammenti di restrizione Confronto con pattern di restrizione appartenenti a specie note.

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PCR Restriction Analysis

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Presentation Transcript

  1. PCR Restriction Analysis

  2. Il principio • hsp65: gene altamente conservato • Digestione con un enzima di restrizione specifico per una sequenza nucleotidica non molto frequente • Determinazione del pattern dei frammenti di restrizione • Confronto con pattern di restrizione appartenenti a specie note

  3. Il metodo • Amplificazione di una porzione di 439 bp all’interno del hsp65 • Digestione dell’amplificato usando (separatamente) 2 diversi enzimi di restrizione • Separazione elettroforetica dei prodotti di digestione di ciascun enzima • Determinazione, per confronto con pesi molecolari noti, delle dimensioni dei frammenti (quelli inferiori a 40 bp vengono ignorati) • Uso di un algoritmo per raggiungere l’identificazione di specie

  4. I frammenti di restrizione • BstEII • nessuna digestione (440 bp) • produzione di 2-3 frammenti (320-80 bp) • HaeIII • produzione di 2-5 frammenti (265-40 bp)

  5. BstEII

  6. HaeIII

  7. BstEII 200/60/50 bp M. chelonae 150/105 bp M. haemophilum 130 bp HaeIII 320 bp 185/130 bp M. terrae 145/130/50 bp M. simiae 130/115/60 bp M. gordonae 130/95/75/60 bp M. kansasii . . . . . . 120 bp hsp65 PRA: l’algoritmo • Differenziazione delle specie, all’interno del pattern di restrizione prodotto da BstEII, in base al pattern prodotto da HaeIII

  8. Sviluppi • Determinazione delle dimensioni esatte dei frammenti, mediante sequenziamento • Presenza di un sito Internet (PRA-Site) contenente tutti i pattern di restrizione delle specie batteriche note

  9. Di facile esecuzione ed economico Svariate specie sono caratterizzate da più di un pattern (fino a 9) Alcune specie hanno pattern indistinguibili Conclusioni

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