PCR

1. PCR

2. PCR이란? # 중합효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)은 DNA 또는 RNA의 특정영역을 시험관 내에 대량으로 증폭하는 획기적인 분자 생물학적 기술이다. # 이 기술은 사람의 게놈과 같은 매우 복잡하며 양이 지극히 미량인 DNA 용액에서 연구자가 원하는 특정 DNA 단편만을 선택적으로 증폭시킬 수 있다. 또한 증폭에 필요한 시간이 2시간 정도로 짧으며, 실험 과정이 단순하고, 전자동 기계로 증폭할 수 있기 때문에, PCR과 여기서 파생한 여러가지 기술은 분자생물학, 의료, 범죄 수사, 생물의 분류 등 DNA를 취급하는 작업 전반에서 지극히 중요한 역할을 담당하고 있다. # 현재는 PCR법도 더욱 다양한 응용 기술이 개발되었다. 이러한 응용 기술로는 역전사효소(reverse transcriptase)를 이용해서 RNA를 직접 증폭시키는 RT-PCR이 대표적이며, 이외에도 형광 물질을 붙여서 PCR을 진행하며 관측되는 정량적인 변화를 이용하여 원래 DNA나 RNA의 양을 정확히 측정하는 정량적 PCR 또는 실시간 PCR(Real time PCR), 한번에 수많은 PCR을 동시에 시행하는 대용량 PCR 같은 여러 방법이 있다.

3. PCR 원리 # PCR의 원리는 극히 단순하다. http://www.youtube.com/watch?v=2KoLnIwoZKU

4. 반응조건 # 증폭될 DNA와 프라이머에 의존하여 반응 온도와 시간이 결정되며, 가장 중요한 것은 프라이머 설계와 결합온도를 결정하는 것이다. (1) DNA 변성(Denaturation) 일반적으로 두 가닥 DNA를 94℃에서 15~30초간 처리하여 각각 한가닥 DNA로 분리시킨다. 너무 온도를 높이거나 처리시간을 지나치게 늘리면 내열성 DNA polymerase라 해도 활성을 잃게되므로 주의가 필요하다. 첫 번째 주기(cycle)에서는 확실한 변성을 위하여 약 5분간 지속시킨다. (2) Primer의 Annealing 열처리로 한 가닥으로 변성한 DNA와 primer를 공존시킨 후 온도를 낮추면 2종류의 primer는 각각 상보적인 한가닥 주형 DNA에 annealing한다. Annealing에 가장 적합한 온도와 시간은 primer의 염기배열과 그 길이에 따라 결정되지만 일반적으로 55℃에서 30초~1분간 annealing한다. 일반적으로 G-C content 가 50%가 되는 primer 쌍을 이용하는 것이 바람직하다. Annealing 온도를 높이면 primer-주형 DNA의 mismatch가 감소되어 반응 특이성이 높아진다. 그러나 혼합 primer 또는 mismatch를 갖는 primer를 사용할 경우는 37~45℃로 annealing 온도를 낮출 필요가 있다. 이 단계에서 primer의 5'→3'방향으로 DNA의 합성이 시작된다.

5. (3) 신장반응(Extension) 4종류의 기질(dNTP)이 공존하는 상태에서, DNA polymerase를 작용시켜 primer를 신장시킨다. 신장반응에 필요한 시간은 주형 DNA의 농도, 증폭단편의 크기, 반응온도에 따라 좌우되지만 일반적으로는 Thermus aquaticus(Taq) polymerase를 사용할 경우 72℃에서30초~10분간(증폭크기 약 10 kbp)처리한다. Taq polymerase에 의한 DNA 합성속도(약 60 nucleotides/sec, 70℃)를 고려하여 시간을 설정한다. PCR 산물의 크기 1kb마다 1분 정도의 시간을 배당하면 충분히 반응이 일어난다. 마지막 cycle에는 약 10분 정도 시간을 충분히 주는 것이 좋다. (4) Cycle 수 PCR의 경우 n회의 cycle로 표적배열은 2n배가 되지만 실제로는 이보다 낮다. 효율이 저하되는 이유는 ① DNA polymerase의 실활 및 증폭단편(주형DNA)의 증가로 인한 효소분자/주형비의 부족과 ② 증폭단편간의 annealing되는 속도가 빨라져서 primer의 anneal과 경합하기때문이다. 따라서 반응 cycle 수를 불필요하게 증가시키는 것은 바람직하지 않다. 보통 20-30회의 반응을 시킨다.

6. 프라이머 설계 • # PCR 반응에서 가장 중요한 일은 원하는 유전자에 정확하고도 특이적으로 결합하는 프라이머를 선정하는 일이다. 프라이머는 대개 15-mer 이상의 길이로 목적하는 유전자만 특이적으로 결합하는 염기서열이어야만 한다. 프라이머의 길이가 길어질수록 비특이적인 결합을 막을 수 있기 때문에 24-30mer로 길게 합성하기도 한다. • # 프라이머 설계시 유의 사항 • 길이는 20-30mer • G+C%가 50-60%로 구성하고 퓨린과 피리미딘 염기의 연속적인 배열을 피한다. • 한 쌍의 프라이머에 부분적인 상보 염기서열이 없어야 한다. 프라이머끼리 결합할 수 있기 때문이다. • 3’ 말단에 티민 오지 않도록 한다. 티민은 자신과 상보적인 뉴클레오티드를 감별하는 능력이 부족하여 mismatch하는 경우가 많다. • 프라이머 3’말단에 G와 C가 3개 이상 연속적으로 오지 않도록 한다. • 두 프라이머의 Tm값은 가능한 동일하게 한다.

7. 반응액의 조성 (1) 내열성 DNA Polymerase 수 종류의 내열성 DNA polymerase가 시판되고 있는데 반응에 사용하는 완충액의 조성이 다를 수 있으므로 주의가 필요하다. TaKaRa Taq을 사용할 때 DNA합성의 최적 온도는 대개 70~80℃ 이고 그 합성속도는 60nucleotides 이상/초이다. 활성 반감기는 92.5℃에서 130분 이상, 95℃에서 약 40분, 97.5℃에서 약 10분간이다. 효소량이 과다일 경우 잘못 결합된 프라이머로부터 DNA가닥이 합성된다. (2) Mg2+ 농도 일반적으로 PCR반응에서는 1.5~2.5 mM의 Mg2+ 농도가 필요하다. Mg2+ 농도는 PCR을 실행할 때 다음의 사항에 관여하고 있는 것으로 여겨진다. ① 효소활성, ②primer의 annealing, ③ 합성된 DNA의 충실성, ④primer-dimer의 형성 등이다. 킬레이트제(예를 들면 EDTA)는 반응액 속의 Mg2+ 농도에 영향을 미치므로 주형으로 사용하는 DNA 용액에서 turn over하는 것에 주의할 필요가 있다. 또한 유효한 Mg2+ 농도는 dNTP 농도와도 관계가 있으므로 어느 실험에서나 최적 Mg2+ 농도를 결정하고자 할 경우 항상 dNTP 농도를 고려해야 한다. 일반 적으로 Mg2+ 농도가 높아지면 DNA 합성의 정확도에 영향을 미칠 뿐만 아니라 두 가닥 DNA 변성이 어려워지고, Taq polymerase는 10 mM MgCl2에 의해 40~50%의 저해를 받으므로 MgCl2를 과잉 첨가하는 것은 바람직하지 않다.

8. (3) dNTP PCR의 효율, 특이성면에서 보면 20~200 μM에서 양호한 결과를 얻을 수 있다. DNA polymerase가 잘못된 dNTP를 사용하는 mismatch 현상은 dNTP 농도에 강하게 의존한다. dNTP 농도를 낮추는 쪽이 PCR 특이성과 정확도가 높아지므로 dNTP 농도를 낮추면 misprimming이 감소하여 PCR의 정확도가 높아진다. 4가지 뉴클레오티드의 농도가 동일해야만 정확한 염기가 결합한다. (4) 주형 DNA, RNA PCR법은 여러 가지 형태의 DNA와 RNA를 주형으로 하여 사용할 수 있다. 가장 간편한 DNA 조제법으로는 소수의 조직배양 세포를 증류수 속에서 가용화하여 PCR에 사용하는 방법이다. 또한 사람의 한 가닥의 머리털로부터 PCR 증폭하는 다형분석, 포르말린으로 고정한 파라핀 조직으로 PCR도 실시하고 있다. 혈액에서 주형 DNA를 조제할 때는 헤모글로빈이나 기타 미지물질이 PCR 반응을 저해하는 점에 주의가 필요하다. 최근 법의학 분석에서 혈액 또는 머리털을 마이크로파 처리하여 그대로 PCR에 이용한다는 보고도 있다. 주형DNA 양으로는 1단계 PCR에서 105~106분자에 상당하는 양이 있으면 양호한 결과를 얻을 수 있고 3X105개의 분자는 human genome DNA에서는 1㎍, 효모 DNA에서는 10ng, 대장균 DNA에서는 1ng에 상당한다.

9. (5) 반응첨가물 많은 염기배열을 복수의 primer set를 사용하여 동시에 1개의 반응 tube 내에서 PCR 증폭하는 방법을 다중 PCR(multiplex PCR)이라 한다. 근육병의 원인인 디스트로핀 유전자의 결실변이를 18종류의 primer를 사용하여 검출할 수 있다. 일반적으로 multiplex PCR반응액에는 10%(v/v) dimethylsulfoxide(DMSO)를 함유한다. 유기용매는 보통 Taq polymerase에는 적합하지 않지만 multiplex PCR에는 필수적이다. Taq polymerase의 저해물질로서 SDS(<0.01%)가 알려졌으나, 비이온 계면활성제 Tween-20이나 nonidet-P40의 첨가로 그 저해를 억제할 수 있다. 또한 DMSO(2~5%),PEG6000(5~15%), 글리세롤(5~20%), 포름아마이드(5%)나 BSA(bovine serum albumine)첨가로 반응 촉진효과를 얻을 수도 있다.

12. 실험:PCR condition test(농도) • 재료 및 장비 • - PCR machine • - DNA template • - Primer(forward, reverse) • - DNase free dH2O • - PCR premix • 1.5% agarose gel • Marker • - 전기 영동기 • - 1.5ml tube • - 파이펫

13. (2) 실험방법 (http://www.youtube.com/watch?v=buxwFXEpdTU&feature=related) • Template를세 가지 농도( 5ng/µl, 0.5ng/µl, 0.05ng/µl)로 희석한다. • Primer 농도: 25pmol/µl • 3. PCR mixture 제조 (negative control 포함) • - PCR premix (2X) 10µl • Template 1µl • Primer(F,R) 0.5µl, 0.5µl • dH2O 8µl • Total 20µl • 4. PCR cycle • Step #1 95 °C 5min • Step #2 95 °C 30sec • Step #3 55 °C 30sec • Step #4 72 °C 1min 30sec 2 19 • Step #5 72 °C 2min • Step #6 4 °C pause running time:?

14. 유전자 조절

15. 어떻게 유전자는 조절되나? # 하나의 개체를 구성하는 세포들은 각각 담당하는 기능에 따라 전혀 다른 모양을 하고 있다. 예를 들어, 정자세포는 다른 세포에서 보기 힘든 편모라는 것을 가지고 있어서 난자를 찾아 헤엄쳐서 이동할 수 있다. # 무엇이 이런 세포의 다양성을 만들었을까? 세포마다 다른 유전자를 가지고 있나? 앞서 생식과 유전에 대해서 배울 때 우리는 하나의 수정란에서 세포분열에 의해 정확하게 복제되기 때문에 우리 몸의 모든 세포는 수정란과 같은 유전체를 갖는다. 그렇다면 세포는 어떻게 서로 다를 수 있을까? 같은 유전정보를 가진 세포가 다른 구조와 다른 기능을 가진 세포가 되는 방법은 유전자 활성을 조절하는 것이다. 즉, 세포가 구조나 기능면에서 특성화되려면 세포분화현상(cellular differentiation)을 겪어야 하는데 이 과정을 이끄는 것이 유전자조절이다.

16. 분화된 세포에서의 유전자 발현 형태 # “어떤 유전자가 활성화되었다” 는 어떤 의미인가? 유전자는 mRNA를 거쳐 단백질로 유전자형이 표현형으로 연결되는 과정을 거치는데 이것을 유전자 발현(gene expression)이라 한다. # 아래 그림 11.3은 성인의 특성화 된 세 종류 세포(이자세포, 안구렌즈세포, 신경세포)에서 4종류의 유전자 활성 상태를 보여주고 있다. 해당과정에 반드시 필요한 효소 유전자는 모든 세포에서 활성화되어 있지만 특수한 단백질은 특정 세포에서만 발현된다. 그림 11.3

17. DNA 마이크로어래이: 유전자 발현을 보여줌 # DNA 마이크로어래이(microarray)는 유전자 발현 정도를 시각화하기 위해 개발된 방법이다. 마이크로 어래이는 어래이(격자)에 수천 종류의 특정 유전자 단일가닥 DNA 조각을 접착시켜 놓은 유리 슬라이드다. # 유전자 발현을 알고자 하는 샘플(특정세포)이 있다면 샘플 세포에서 발현하는 모든 mRNA를 추출한후 역전사효소를 이용해서 상보적 DNA(complementary DNA)로 만든다. 이때 형광체로 표지된 뉴클레오티드로 합성하며 이렇게 형광으로 표지된 cDNA 혼합물을 마이크로 어래이와 섞어준다. cDNA가 특정 위치의 마이크로어래이 DNA조각과 상보적이라면 그 자리에 결합되어 고정될 것이고 결합하지 못한 cDNA는 씻어내면 떨어져 나간다. 결국 형광을 띠는 패턴을 보면 샘플의 세포에서 어떤 유전자가 활성화되어 있는지 알 수 있다. 이 방법을 통해 조직간에 개체간에 유전자발현차이를 빠르고 정확하게 알 수 있게 되었다.

18. 세포의 유전적 잠재능 # 세포 하나는 개체의 완전한 DNA 한 세트를 갖고 있기 떄문에 유전자 발현 패턴만 바뀐다면 모든 세포로 분화하는 잠재능을 가지고 있다. 식물의 경우 하나의 성체 세포가 완전한 성체로 자라게 하는 것은 그리 어렵지 않다. 이런 기술로 식물의 체세포를 가지고 수 천개의 동일한 개체(클론, clone)을만든다. 이런 경우 분화된 성체 세포가 탈분화(분화를 잃어버리고)하여 다양한 세포로 분화될 수 있음을 보여준다. # 동물의 경우 도마뱀의 잘라진 다리에서처럼 손실된 신체의 일부가 자라나는 재생(regemeration) 역시 탈분화의 예다.

19. 동물의 생식적 복제 • # 분화된 세포로부터 핵을 채취하여 난자의 핵과 치환하는 핵이식 (nuclear transplantation)실험은 여러가지 동물 복제 실험에 이용되고 있다. • # 생식적 복제 이용 • 축산업계:우량품종의 대량 생산 • 제약업계 • 멸종위기종 보존

20. 치료용 복제와 줄기세포 # 치료용 복제의 목적은 살아있는 생물체가 아니라 배아줄기세포를 만드는 것이다. # 배아줄기세포(enbryonic stem cell:ES cell)는발생과정에서 신체의 모든 다양한 세포로 분화되는 동물의 초기 배아세포를 말한다. 실험실에서 무한적으로 증식할 수 있으며 배양조건에 따라 특정 세포로 분화시킬 수도 있다. 미래에는 조직이 손상된 환자의 세포로부터 핵을 꺼내 배아줄기세포를 만들어 기관으로 발생시킨 후 환자에게 이식시켜 줄 수도 있을 것이다. # 성체줄기세포(adult stem cell)는 성체에 존재하는 몇 개의 세포로 분화과정이중간 정도 진행된 세포다.

21. 유전자 발현조절 # 어떻게 한 세포에서 정확하게 유전자 발현이 조절되는 것인가? 진핵세포에서 유전자가 단백질로 발현되는 과정은 여러 단계 과정이며, 그 과정을 켜기/끄기 또는 빠르게/천천히 작동하도록 조절하는 제어장치가 있다.

22. 대장균의 유전자 발현 조절: 젖당 오페론 # 유전자 조절은 진핵생물보다 단순한 세균에서 먼저 발견되었는데 유전자 조절 원리를 설명해 줄 수 있는 가장 잘 알려진 유전자 조절이 바로 젖당 대사과정이다. # 젖당대사에 관여하는 유전자는 세가지 인데 이들 세 유전자는 나란히 위치하고 있어서 한 단위로 하나의 조절염기서열부위가 조절한다. 조절부위(프로모터와작동인자)와 연결된 유전자 모둠을 오페론(operon)이라고 한다. # DNA 조절염기서열부위 중 프로모터(promoter)는 RNA중합효소가 붙어서 전사가 시작되는 부위인데 프로모터와 유전자 사이에 작동인자(operator)가 있어서 스위치 역할을 한다.

23. 유전자 조절: 진핵생물의 핵에서 유전자 조절 # DNA 압축에 의한 조절: DNA가 압축되어 있으면 RNA 중합효소나 다른 전사효소들이 DNA에 결합하는 것을 방해함으로써 유전자가 발현되는 것을 막을 수 있다. 세포분열시 염색체 형태 뿐 아니라 간기 시기에도 특정부위는 극도로 응축되어 있어서 전사가 일어나지 않는다는 점으로 볼 때 전사가 일어나기 위해서는 DNA 압축이 느슨하게 풀려야 한다. # 세포는 어떠한 유전자를 장기적으로 사용하지 않을 시 그 부위를 압축시켜 놓는 것으로 판단된다.

24. 유전자 조절: 진핵생물의 핵에서 유전자 조절 # 전사의 개시: 가장 중요한 유전자 발현 조절단계는 전사 작용 단계다. 박테리아 오페론의 유전자들과 다르게 진핵세포의 각 유전자들은 자신만의 프로모터와 조절염기서열부위를 갖는다. 또한 세포의 특성을 위해 필요한 유전자의 스위치만을 켤 필요가 있기 때문에 활성자(activator)를 사용하는 것이 효율적이다. # 포도당 대사처럼 항상 켜 놓아야 하는 집지킴이(housekeeping gene)을 제외하고는 대부분의 유전자는 “꺼짐” 상태로 설정되어 있다. # 진핵세포 유전자를 켜기 위해서는 RNA중합효소와 더불어 전사인자(transcription factor)라는 조절 단백질이 있어야 한다. 전사인자 중에 하나인 활성자 단백질이 증폭자(enhancer)에 결합하여 구부러짐으로써 다른 전사요소들과 상호작용하여 프로포터에 정확하게 결합한다.

25. 유전자 조절: 진핵생물의 핵에서 유전자 조절 # RNA 변형: 진핵세포는 전사 후 가공과정을 거친 후 세포질로 나간다. 이미 배운대로 가공과정이란 mRNA에 모자와 꼬리를 붙이는 일과 인트론 부위를 제거하는 일을말한다. # 인트론 부위를 잘라서 엑손만을 짜집기 하는 스플라이싱 과정에서 여러 종류의 선택성 RNA 이어맞추기(alternative RNA splicing)가 일어나 한 유전자에서 하나 이상의 폴리펩티드를 만들 수 있다. 즉, 같은 유전자에서 다른 엑손을 선택함으로써 두 종류의 세포는 똑같지 않은 단백질을 만든다. # 가공과정 후 mRNA가 핵에서 세포질로 이동할 때 이동을 방해하거나 촉진하는 방식으로 유전자 발현을 조절 할 수도 있다.

26. 유전자 조절: 진핵생물의 세포질에서 유전자 조절 # 진핵세포의 mRNA가 세포질로 운반된 후에도 조절 기회가 있다. # mRNA 파괴: mRNA 분자는 몇시간 또는 수주일까지 되는 수명을 가지고 있어서 단백질 양을 제어할 수 있다. # 번역 작용의 조절: 번역작용에 관여하는 분자 중에 조절기능을 하는 단백질들이 있다. 예를 들어 적혈구 세포에서 철함유 기능기인 헴이 부족하면 헤모글로빈 mRNA의번역을 막는 단백질이 있다. # 단백질의 변형: 진핵세포에서 번역 후 만들어진 폴리펩티드는 불활성인 긴 사슬인 경우가 대부분이고 잘려져 활성을 갖는 최종산물이 된다. # 단백질 파괴: 세포의 환경에 따라 선택적으로 특정 단백질을 파괴함으로써 단백질의 양과 종류를 제어한다.

27. 세포신호전달 # 유전자조절은 하나의 세포내에서만 일어나는 것이 아니라 세포 사이에서도 일어난다. 근접한 세포 뿐 아니라 멀리 떨어져 있는 세포에도 호르몬 같은 물질을 분비하여 신호를 전달한다. # 신호분자란 일반적으로 표적세포의 세포막에 있는 수용체 단백질과 결합함으로써 세포의 신호전달과정, 즉 표적세포 표면에서 받은 신호를 세포 안의 특정 반응으로 변환하는 일련의 분자변화다.