Genomic Mapping Techniques: Importance and Applications

1. GENOMİKLER TBT408 1

2. • Genomes 4; T.A. BROWN, Garland Sciences, 2018 • From Genes to Genomes, 3rd ed. Concepts and Applications of DNA Technology, Jeremy W. Dale, Malcolm von Schantz and Nick Plant, University of Surrey, UK • Güncel makaleler • Konu ile ilgili videolar KAYNAKLAR TBT408-GENOMİKLER 2

3. • Genom, Transkriptom, ve Proteom 07.03.2023 • DNA çalışmaları 14.03.2023 • Genom Haritalama 21.03.2023 • Genom Dizileme 28.03.2023 • Genom Atıflandırma (annotasyon) 04.04.2023 • Gen Fonksiyonlarını Belirleme 11.04.2023 TBT408- GENOMİKLER DERS PLANI • Ökaryotik Nüklear Genomlar 18.04.2023 • Prokaryot Genomları-Ökaryotik Organel Genomları 25.04.2023 • Viral Genomlar ve Hareketli Genetik Elementler 09.05.2023 • DNA-Bağlama Proteinleri ve Gen İfadeleri 16.05.2023 29 Nisan 2023-7 Mayıs 2023 Ara sınav haftası 9 Haziran 2023 Derslerin Bitimi • Transkriptom 23.05.2023 • Proteom 30.05.2023 • Metagenom/Metabolom 06.06.2023 3

4. DEĞERLENDİRME • Ara sınav ve Ödev-1_____%40 • Final Sınavı ve Ödev-2___%60 Arasınav Final Sınavı Ödev-1 Ödev-2 4

5. BÖLÜM 3: Genom Haritalama 5

6. Giriş • Genetik haritalama: Bağlantı analizi olarak da adlandırılır. Planlanmış çaprazlama deneyleri veya insanlarda olduğu gibi, aile geçmişlerinin incelenmesi (soy ağacı)ni kapsayan genetik tekniklerin kullanılmasına dayalıdır. • Fiziksel haritalama: Genler de dahil olmak üzere dizi özelliklerinin konumlarını belirlemek amacıyla doğrudan DNA moleküllerini incelemek üzere moleküler biyoloji tekniklerini kullanır. 6

7. Genetik Harita 7

8. 3.1. GENOM HARİTASI NEDEN ÖNEMLİDİR? Genom haritaları çok daha kompleks genomları dizilemek için gereklidir. Genom haritaları sadece dizileme yardımcıları değildir. 8

9. Genom haritaları çok daha kompleks genomları dizilemek için gereklidir. • Genom araştırmasının ilk günlerinde, ayrıntılı bir haritaya sahip olmanın, bir genomun doğru dizilimini oluşturmak için temel bir ön koşul olacağına inanılıyordu. • Çünkü DNA dizilemenin önemli bir sınırlamasının söz konusuydu: Ancak günümüz teknolojisi ile tek bir deneyde yaklaşık 750 bp'den daha fazla bir dizi elde etmek mümkündür. • Bunun anlamı, uzun bir DNA molekülünün dizisinin bir dizi daha kısa diziyi birleştirerek oluşturulması gerektiğidir. • Bu, DNA molekülünü küçük parçalara ayırarak, her birini dizileyerek, ve örtüşmeleri arayıp master (ana) sekansı dizisini oluşturmak için bir bilgisayar kullanarak yapılır (Şekil 3.1). • Bu shotgun yöntemi, genom diziliminde standart yaklaşımdır, ancak iki kısıtlaması bulunmaktadır. 9

10. Dizi montajı (assembly) için shotgun(av tüfeği) yöntemi Aktif protein kodlayan genlerin kopyaları Şekil 3.1. DNA molekülü küçük parçalara bölünür,her bir parça dizilenir. Bireysel fragmanların dizileri arasındaki örtüşmeler dikkate alınarak birleştirilir ve ana dizi oluşturulur.

11. Shotgun dizilemenin sınırlılıkları-1 Özellikle daha büyük genomlarda, tüm genomu elde etmek amacıyla bitişik bir DNA dizisi üretmede kısa diziler yetersiz kalabilir. Bitişik bir DNA dizisi elde etmek yerine, genom dizisi, genomun şans eseri elde edilen dizilerin kapsayamadığı boşluklar oluşabilir (Şekil 3.2). Bu segmentler bağlantısızsa, genom dizisini oluşturmak için birbirlerine göre nasıl doğru şekilde konumlandırılabilirler? Cevap, genom haritasında bulunan bu segmentler içindeki özellikleri tanımlamaktır. Segmentleri haritaya sabitleyerek, bu dizi hala bazı boşluklar içeriyor olsa bile doğru genom dizisi elde edilebilir. 11

12. Dizi montajına(assembly ) yardımcı olmak için genom haritasnın kullanılması Şekil 3.2. Genom, shotgun yöntemiyle dizilenen kısa DNA parçalarına bölünmüştür. Diziler birleştirildiğinde, bir dizi bağlantısız genom segmenti elde edilir. Segmentler, genomdaki konumları haritalanmış olan genleri ve diğer dizi özelliklerini (A, B, C, vb.) içerir. Bu nedenle harita, genom dizisindeki bölümlerin konumlarını belirlemek için kullanılabilir.

13. Shotgun dizilemenin sınırlılıkları-2 Shotgun yaklaşımıyla ilgili ikinci sorun, genomun tekrarlayan DNA dizileri içermesi durumunda hatalara yol açabilmesidir. Bunlar, bir genomda iki veya daha fazla yerde tekrarlanan, birkaç kilobaz uzunluğundaki dizilerdir. Tekrarlayan DNA içeren bir genom parçalara ayrıldığında, ortaya çıkan parçalardan bazıları aynı dizi motiflerini içerecektir. Bu dizileri, tekrarlar arasındaki DNA'nın bir kısmı dışarıda kalacak şekilde yeniden birleştirmek, hatta aynı veya farklı kromozomların oldukça ayrı iki parçasını birbirine bağlamak gibi hatalar yapılabilir (Şekil 3.3A). Genom haritasının kullanılması bu tür hataların önlenmesini sağlar. Tekrarlayan bir bölgenin her iki tarafındaki dizi özellikleri genom haritasıyla eşleşiyorsa, o bölgedeki dizi doğru bir şekilde bir araya getirilmiştir. Sıralama ve harita uyuşmuyorsa, bir hata yapılmıştır ve montajın revize edilmesi gerekir (Şekil 3.3B). 13

14. Sekans birleştiriken tekrarlı DNAların neden olduğu hata (A) DNA molekülü, bir tekrar dizisinin iki kopyasını içerir. Tüfek sekansları incelendiğinde iki parçanın üst üste bindiği görülmektedir, ancak bir parça bir tekrarın sol tarafını, diğer fragman ise ikinci tekrarın sağ tarafını içermektedir. Bu montaj hatasının tanınmaması, iki tekrar arasındaki DNA segmentinin ana dizinin dışında kalmasına yol açacaktır. İki tekrar farklı kromozomlarda olsaydı, bu kromozomların dizileri yanlışlıkla birbirine bağlanırdı. (B) Dizi düzeneğindeki hata belirlenebilir çünkü birleştirilmiş dizideki haritalanan özelliklerin (A, B, C, vb.) göreli konumları, bu özelliklerin genom haritasındaki doğru konumlarına karşılık gelmez. Şekil 3.3.

15. Dizileme Teknolojileri ve algoritmalar •Dizileme teknolojisinin güçlenmesi ile tek bir genomdan çok fazla sayıda kısa diziler üretilerek son dizide boşluk olma olasılığı düşürülmüştür. •Aynı zamanda, bu dizileri daha büyük sekanslar halinde birleştirmek için daha üst düzey bilgisayar algoritmaları kullanılmaktadır. •En yeni algoritmalar, montajın tekrarlayan DNA bölgesine ulaştığını fark edebilmekte ve bu bölgelerin etrafındaki dizinin yanlış bir şekilde bir araya getirilmesini önleyecek adımlar atabilmektedir (Bölüm 4.3). Haritalar bu nedenle günümüzde daha az önemli hale gelmiştir. •Pek çok prokaryotik genom, nispeten küçük ve çok az tekrarlayan DNA'ya sahip olup genetik harita yardımı olmaksızın dizilenmiştir. Artan sayıda ökaryotik genom projeside haritaya başvurmadan dizilenmektedir. Asıl sorun yüksek tekrarlı DNA ya sahip bitki genom dizilenmesindedir. 15

16. Büyük genomlar ve yüksek tekrarlı DNA içeren bitki genomlarının dizilenmesi ve haritaya olan gereksinim Günümüzün en büyük zorluklarından biri, önemli ekin bitkileri için genom dizileri elde etmektir. Bu türlerin çoğu, önemli ölçüde tekrarlayan DNA içeriğine sahip büyük genomlara sahiptir. Hem gıda hem de biyoyakıt olarak kullanılan bir bitkisel yağ kaynağı olan ayçiçeği Helianthus annuus buna bir örnektir. Onun genomu, insan genomundan sadece biraz daha büyüktür (insanlar için 3235 Mb ile karşılaştırıldığında H. annuus için 3600 Mb), ancak insan genomu için sadece %44'e ayçiçeği genomu için ise %80’e karşılık gelen tekrarlayan DNA'dan oluşur. Arpa genomu da yaklaşık %80 tekrarlayan DNA'ya sahiptir ve genomu 5100 Mb’dir. Bir hekzaploid olan yani A, B ve D olarak adlandırılan üç genomu olan ekmeklik buğdayda durum daha karışıktır (Her bir genom yaklaşık 5500 Mb,toplamda 16.500 Mb) ve arpaya benzer oranda tekrarlayan DNA içeriğine sahiptir. Bu ve diğer önemli mahsuller için genom projeleri halen devam etmektedir ve genomlarının karmaşıklığı nedeniyle, dizileri bir araya getirmek için kapsamlı haritalar gereklidir. Bu kritik bir araştırma alanıdır: Mahsullerin biyolojisinin tüm yönlerini anlamak, önümüzdeki yıllarda küresel açlıkla başa çıkmak için çok önemlidir. 16

17. Genom haritaları sadece dizileme yardımcıları değildir. • Haritaların, genom dizilerinin birleştirilmesinde yardımcı olmak dışında da kullanılmaktadırlar. • Sadece A, G, C ve T bazlarının diziliminden oluşan genomu anlamlandırmak, genlerin ne işe yaradığını, genom üzerindeki konumlarını bilmek önemlidir. Ayrıca bir işlevden yola çıkarak sorumlu genin bulunması da önemli ve gereklidir. • İşte bu ikinci aşamada genom haritası gereklidir, çünkü başlangıçta kullanılan yaklaşım, haritadaki konumları zaten bilinen diğer genlere veya dizi özelliklerine göre aranan genin konumunu tanımlamayı içerir. Bu süreç, kistik fibroz ve meme kanseri gibi insan hastalıklarından sorumlu genlerin tanımlanmasında anahtar olmuştur ve olmaya devam etmektedir. • Doğrudan bir hastalığa neden olmayan, ancak o hastalığa farklı derecelerde duyarlılık kazandıran, muhtemelen genomun etrafına yayılmış gen gruplarını tanımlamak için benzer yöntemler kullanılır. Bir adım daha ileride, çiftlik hayvanlarında et üretkenliği ve mahsul bitkilerinde haşere direnci gibi değişken özellikleri kontrol eden, her biri muhtemelen birkaç gen içeren genom bölgeleri olan nicel özellik lokuslarını (QTL'ler) belirlemek için kullanılan yöntemler vardır. 17

18. QTL ve tarımda önemi • Islah programlarında kültür bitkilerinde ticari olarak önemli özellikleri kontrol eden genlerin ve QTL'lerin konumları hakkında genom haritasının sağladığı bilgiler kullanılarak istenen özellikte yeni çeşitlerin geliştirilmesi mümkündür. • Islah programlarında, kalıtım sürecinin rastgeleliği nedeniyle kesin biyolojik özellikleri bilinmeyen binlerce fide üretilir. • Bir fide, iki ebeveynin en iyi özelliklerini bir araya getirebilir ve potansiyel olarak önemli bir yeni ürün çeşidi olabilir. Ya da, her iki ebeveynin en az yararlı özelliklerini birleştirebilir ve ticari değeri olmayabilir. • Bu özelliklerin belirlenmesi meyve ve tohum oluşturma sürecine uzanan uzun bir zamanı kapsar ve tüm fidelerin ekimi maliyetlidir ve geniş tarım arazileri gerektirir. • Bu aşmada Markör Destekli Seçilim (MAS), fidelerde DNA taraması yaparak istenilen yararlı özelliklere sahip fidelerin seçilimini sağlamaktadır. MAS; yalnızca bir genom haritası mevcutsa mümkündür. Bir genom haritası varsa, arpa ve buğday gibi ekinlerde olduğu gibi bitkinin tam genom dizisi bilinmese bile seçilim başarıyla gerçekleştirilebilir. 18

19. 3.2. GENETİK HARİTALAMADA MARKÖRLER Genler kullanılan ilk markörlerdir. RFLP ve SSLP ler DNA markörlerine örnektir. Tek nükleotid polimorfizmleri (SNP) en kullanışlı DNA markör tipidir. 19

20. Genler kullanılan ilk markörlerdir-Morfolojik markörler • Yirminci yüzyılın başlarında oluşturulan meyve sineği gibi organizmalar için ilk genetik haritalar olşturulurken, genleri genetik markör olarak kullanılmıştır. • Genetik analizde yararlı olması için, bir genin her biri farklı bir fenotip belirten en az iki formda veya alelde bulunması gerekir. Başlangıç olarak, incelenebilecek tek genler, görsel olarak ayırt edilebilen fenotipleri belirleyen genlerdi.Örneğin Gregor Mendel tarafından incelenen bezelye bitkilerindeki uzun veya kısa saplı oluşları. • Örneğin, ilk meyve sineği haritaları vücut rengi, göz rengi, kanat şekli vb. özellikler için genlerin pozisyonlarını göstermekteydi. Ve bu özelliklerin diseksiyon mikroskobu veya bazıları çıplak gözle bile görülebilmekteydi. • Ancak, kalıtımı incelenebilen sınırlı sayıda görsel fenotip olduğundan ve çoğu durumda, tek bir fenotip birden fazla gen tarafından etkilenebileceğinden aalizleri karmaşıktı. . Örneğin, 1922'de, 50'den fazla gen, dört meyve sineği kromozomuna eşlendi, ancak bunlardan dokuzu göz rengi içindi. Daha sonraki araştırmalarda, meyve sineklerini inceleyen genetikçiler, kırmızı, açık kırmızı, vermilyon, lal, karanfil, zinober, yakut, sepya, kızıl, pembe, kardinal, bordo, mor veya kahverengi renkli sinek gözlerini ayırt etmeyi öğrenmek zorunda kaldılar. • Bu nedenle, gen haritalarını daha kapsamlı hale getirmek için, görsel olanlardan daha ayırt edici ve daha az karmaşık özellikler bulmak gerekiyordu. 20

21. Genler kullanılan ilk markörlerdir-Biyokimyasal markörler • Özellikle mikroorganizmalar ve insanlarda, fenotipleri ayırt etmek için biyokimyayı kullanılmştır. Bakteri ve maya gibi mikroorganizmaların çok az görsel özelliği vardır, bu nedenle bu organizmalarla gen haritalaması, Tablo 3.1'de listelenenler gibi biyokimyasal fenotiplere dayanmak zorundadır. 21

22. Genler kullanılan ilk markörlerdir-Biyokimyasal markörler • İnsanlar için görsel özellikleri kullanmak mümkündür, ancak 1920'lerden bu yana, insan genetik varyasyon çalışmaları büyük ölçüde kan gruplaması ile puanlanabilen biyokimyasal fenotiplere dayanmaktadır. Bu fenotipler, yalnızca ABO serisi gibi standart kan gruplarını değil, aynı zamanda kan serum proteinlerinin ve insan lökosit antijenleri (HLA sistemi) gibi immünolojik proteinlerin varyantlarını da içerir. Bu markörlerin büyük avantajı, ilgili genlerin birçoğunun çoklu alele sahip olmasıdır. • Örneğin, HLA-DRB1 adlı genin 1800'den fazla aleli vardır ve HLA-B'nin 4200 aleli vardır. Bu, insanlarda gen haritalamanın nasıl yapıldığı ile ilgilidir. • Meyve sinekleri veya fareler gibi deneysel organizmalarda uygulanan prosedür gibi planlı üreme deneyleri oluşturmak yerine, insan genlerinin kalıtımı ile ilgili veriler, ziyade kişisel nedenlerle bir araya gelen ebeveynlerin bulunduğu ailelerin üyeleri tarafından sergilenen fenotipler incelenerek derlenmelidir. • Bir ailenin tüm üyeleri çalışılan gen için aynı alele sahipse, o zaman yararlı bir bilgi elde edilemez. Bu nedenle, gen haritalama çalışmalarında, ebeveynlerin şans eseri farklı alellere sahip olduğu aileleri bulmak gereklidir. Çalışılan genin 2 aleli yerine 1800 aleli varsa, bu çok daha olasıdır. 22

23. RFLP ve SSLP ler DNA markörlerine örnektir. • Genler çok yararlı olmakla birlikte kesinlikle ideal markör değillerdir. • Özellikle omurgalılar ve çiçekli bitkiler gibi daha büyük genomlarda, tamamen genlere dayalı bir haritanın çok ayrıntılı olmaması bir sorundur. Aslında, her gen haritalanabilse bile sorun devam etmektedir, çünkü çoğu ökaryotik genomda genler, arasında büyük boşluklar bulunmaktadır (tekrarlı DNA lar). • Diğer bir sorun ise birçok genin kolayca ayırt edilebilecek alelik formlarda bulunmaması durumuyla ilgilidir. • Bu nedenle gen haritaları çok kapsamlı değildir. Başka tür işaretleyicilere ihtiyacımız var. • Gen olmayan haritalanmış özelliklere DNA markörleri denir. Gen markörlerinde olduğu gibi, bir DNA markörünün kulanılabilmesi için en az iki aleli olmalıdır. DNA markörlerine iki örnek, Restriksiyon fragman uzunluğu polimorfizmleri (RFLP'ler) ve olarak adlandırılan dizilerdir. 23

24. DNA markörleri: RFLP • RFLP'ler, çalışılan ilk DNA markörü tipidir. Restriksiyon enzimleri DNA moleküllerini belirli tanıma dizilerinden kestiğinden, bu dizi özgüllüğü, bir DNA molekülünün bir restriksiyon enzimiyle muamele edildiğinde her zaman aynı fragmanları üretmesini gerektirir. • Ancak, bazı restriksiyon kesim bölgeleri polimorfiktir, iki alel olarak bulunur, bir alel restriksiyon bölgesi için doğru diziye sahipken ve bu nedenle DNA enzimle muamele edildiğinde kesilirken ve ikinci alel bir dizi değişikliğine sahip olabilir ve bu yüzden enzim tanıma dizisi değiştiğinden bu bölgeden DNA yı kesemez. Sekans değişikliği, enzimle işlemden sonra birbirine bağlı kalan iki bitişik fragman oluşur sonuçlanır ve bu da bir uzunluk polimorfizmine yol açar (Şekil 3.4). • Bu bir RFLP'dir ve bir genom haritası üzerindeki konumu, tıpkı genler işaretleyici olarak kullanıldığında yapıldığı gibi, alellerinin kalıtımı izlenerek hesaplanabilir. 24

25. DNA markörleri: RFLP • Bir memeli genomunda yaklaşık 105 RFLP olduğu düşünülmektedir. • Küçük DNA moleküllerinde, bir RFLP'nin iki aleli, basitçe uygun restriksiyon enzimi ile kesilerek ve bir agaroz jelde ortaya çıkan fragmanların boyutları belirlenerek ayırt edilebilir. • Ancak bir RFLP'yi genomik DNA'da incelemek daha zordur. Söz gelimi, EcoRI gibi altı nükleotit tanıma dizisine sahip bir enzim yaklaşık olarak her 46= 4096 bp'de bir DN’yı kesmelidir ve bu nedenle insan DNA'sı ile kullanıldığında neredeyse 800.000 parça oluşacaktır. Agaroz jel elektroforezi ile ayrıldıktan sonra, bu 800.000 fragman bir DNA sürüntüsü üretir. RFLP’yi ayırt etmem mümkün değildir. 25

26. DNA markörleri: RFLP • Bu nedenle, RFLP ile ilgili fragmanları görselleştirmek için polimorfik restrikiyon bölgesini kapsayan bir prob kullanılarak Southen hibridizasyonunun gerçekleştirilmesi gerekir (Şekil 3.5A). Bu uzun bir süreçtir ve tek bir deneyde yaklaşık 12 DNA örneğinden fazlasını incelemek zordur. • RFLP tiplendirmesi, PCR'nin icat edilmesiyle oldukça kolaylaşmıştır. PCR kullanılarak yapılan bir RFLP, DNA'yı restriksiyon enzimi ile kesmeye gerek kalmadan bir genomik DNA örneğine tiplendirilebilir. Bu metodda, PCR primerleri, polimorfik bölgenin her iki yanına bağlanacak şekilde tasarlanır ve PCR ürünü enzim ile kesilerek RFLP belirlenir (Şeki 3.5B). 96 kuyucuklu PCR cihazları kullanılarak aynı anda çok sayıda DNA örneğinde RFLP tiplendirmesi yapılabilir. 26

27. İki RFLP Metodu • (A) DNA, uygun restriksiyon enzimi ile kesilir ve agaroz jelde ayrımlanır. restriksiyon fragmanları, bir naylon zara aktarılır ve polimorfik restriksiyon bölgesini kapsayan bir DNA probu ile incelenir. Enzim tanıma dizisi yoksa (polimorfizm varsa)tek bir bant tespit edilir (kuyucuk 2); enzim tanıma dizisi bulunuyorsa (polimorfizm yoksa), iki bant tespit edilir (kuyucuk 3). • (B) RFLP, polimorfik kısıtlama bölgesinin her iki tarafına bağlananprimerler kullanılarak PCR ile de bulunabilir. PCR sonrası ürünler uygun restriksiyon enzimi ile işleme tabi tutulur ve agaroz jel elektroforezi ile analiz edilir. Enzim tanıma dizisi yoksa agaroz jel üzerinde bir bant görülür (kuyucuk 2); varsa, iki bant görülür (kuyucuk 3). 27

28. DNA markörleri: SSLP • SSLP'ler RFLP'lerden oldukça farklıdır. SSLP'ler, farklı sayıda tekrar birimi içeren farklı alellerle uzunluk değişimlerini gösteren tekrar dizileri dizilimleridir (Şekil 3.6A). RFLP'lerin aksine, SSLP'ler çok alelik olabilir, çünkü her SSLP bir dizi farklı uzunluk varyantına sahip olabilir. İki tür SSLP vardır: Minisatelitler-VNTRlar •Değişken sayıda ardışık tekrarlar olarak da bilinmektedir. Tekrar biriminin uzunluğu 25 bp'ye kadardır Mikrosatelitler-STRler •Kısa ardışık tekrarlar olarak da adlandırılırlar, daha kısa (13 bç ve daha az) ardışık tekrarlar içerirler. 28

29. Mikrosatelitler minisatelitlerden daha popülerdir. Çünkü: • Minisatelitler genomda eşit olarak yayılmazlar, ancak kromozomların uçlarındaki telomerik bölgelerde daha sık bulunma eğilimindedirler. Mikrosatelitler, genom boyunca daha uygun bir şekilde yerleştirilmiştir. 1 •İkincisi, bir uzunluk polimorfizmi bulmanın en hızlı yolu PCR'dir, ancak PCR ile tipleme uzunluğu 300 bç'den az olan dizilerle çok daha hızlı ve daha doğrudur. Çoğu minisatelit aleli bundan daha uzundur, çünkü tekrar birimleri nispeten büyüktür ve tek bir dizide bunların birçoğu olma eğilimindedir, bu nedenle onları tiplendirmek için birkaç kilobaz uzunluğundaki PCR ürünlerine ihtiyaç vardır. 2 •DNA markörleri olarak kullanılan mikrosatelitler tipik olarak 6 bç'den daha uzun olmayan bir tekrarın 10-30 kopyasından oluşur ve bu nedenle PCR ile analize çok daha uygundurlar. 29

30. SSLP • İnsan genomunda tekrar birimleri 2-6 bç olan 2.86 × 106mikrosatelit vardır. PCR ile incelendiğinde, bir STR'de bulunan alel, PCR ürününün kesin uzunluğu ile ortaya çıkar (Şekil 3.6B). Uzunluk değişimleri, agaroz jel elektroforezi ile görselleştirilebilir, ancak standart jel elektroforezi, otomatikleştirilmesi zor olan hantal bir prosedürdür; dolayısıyla, modern genom araştırmalarında gerek duyulann yüksek verimli analizler için uygun değildir. • Bunun yerine, STR'ler genellikle bir poliakrilamid jel içinde kapiler (kılcal) elektroforez ile tiplendirilir. Poliakrilamid jeller, agaroz jellerden daha küçük gözenek boyutlarına sahiptir ve farklı uzunluklardaki moleküllerin ayrılmasında daha fazla hassasiyet sağlar. • Çoğu kapiler elektroforez sistemi floresan algılama kullanır, bu nedenle PCR öncesinde primerlerin birine ya da her ikisine floresan etiketler eklenir. PCR sonrasında, ürün kılcal sisteme yüklenir ve bir floresan detektöründen geçer. Dedektöre bağlı bir bilgisayar, PCR ürününün geçiş zamanını bir dizi boyut işaretçisi için eşdeğer verilerle ilişkilendirir ve böylece ürünün kesin uzunluğunu tanımlar. 30

31. SSLP ve tespiti (A) Bir SSLP'nin iki aleli. Bu özel örnek, mikrosatelit olarak da adlandırılan kısa bir ardışık tekrardır (STR). 1. alelde GA motifi üç kez, 2. alelde ise beş kez tekrarlanır. (B) PCR ile bir STR tespiti. STR ve çevreleyen sekansın bir kısmı amplifiye edilir ve ürünün boyutu, agaroz jel elektroforezi veya kapiler elektroforez ile belirlenir. Agaroz jelde, kuyucuk 1 PCR ürününü içerir ve kuyucuk 2, iki alelin PCR'den sonra verilen bantların boyutlarını gösteren DNA markörleerini içerir. Kuyucuk 1'deki bant, iki DNA marköründen daha büyük olanla aynı boyuttadır ve test edilen DNA'nın 2. alel içerdiğini gösterir. Kapiler elektroforezin sonuçları bir elektroforetogram olarak görüntülenir. Mavi tepe noktasının konumu, PCR ürününün boyutunu gösterir. Elektroforetogram, PCR ürününün kesin uzunluğunun hesaplanabilmesi için boyut markörlerine (kırmızı pikler) göre otomatik olarak kalibre edilir. 31

32. Tek nükleotid polimorfizmleri (SNP) en kullanışlı DNA markör tipidir • Modern genetik haritalama projelerinin çoğu, DNA markörü olarak ftek nükleotid polimorfizmleri (SNP'ler)ni kullanır. • Bir SNP, bazı bireylerin bir nükleotide (örneğin, bir G) sahip olduğu ve diğerlerinin farklı bir nükleotide (örneğin, bir C) sahip olduğu bir genomdaki bir konumdur (Şekil 3.7). 32

33. SNP • Her genomda çok sayıda SNP vardır (insan genomunda yaklaşık 10 milyon). Bazıları aynı zamanda RFLP'lere neden olur, ancak birçoğu, içinde bulundukları dizi herhangi bir restriksiyon enzimi tarafından tanınmadığından, RFLP'lere yol açmaz. • Dört nükleotitten herhangi biri, bir genomdaki herhangi bir tek pozisyonda mevcut olabilir, dolayısıyla teorik olarak her SNP'nin dört aleli olması gerektiği düşünülebilir. Ancak pratikte çoğu SNP sadece iki varyant olarak mevcuttur. Bunun nedeni ise her SNP'nin bir genomda bir nükleotidi diğerine dönüştüren bir nokta mutasyonu meydana geldiğinde ortaya çıkmasıdır. 33

34. SNP • Mutasyon, bir bireyin üreme hücrelerinde meydana gelirse, o bireyin yavrularından bir veya daha fazlasına mutasyon aktarılabilir ve birçok nesil sonra, SNP popülasyonda yerleşik hale gelebilir. • SNP'lerin büyük çoğunluğu bialeliktir: orjinal sekans ve onun mutasyona uğramış veriyonu. Bu nedenle SNP'ler, çok ayrıntılı genom haritalarının oluşturulmasını sağlar. • Bir genomdaki SNP'lerin sıklığı, bu markörlerin, belirli özellikleri belirleyen genleri veya QTL'leri tanımlamak için bir genom haritası kullanan projelerde önemlidir. Ayrıca, MAS’a yardımcı olarak ahrita kullanan mahsul ıslah programlarında önemlidir. • Bu uygulamalar, bireysel SNP'lerin yanı sıra büyük SNP setlerinin hızlı tiplendirilmesi için yöntemlerin geliştirilmesini sağlamıştır. Bu tiplendirme yöntemlerinin birçoğu, oligonükleotit hibridizasyon analizine dayanmaktadır. 34

35. SNP • Bu tiplendirme yöntemlerinin birçoğu, oligonükleotit hibridizasyon analizine dayanmaktadır. Bir oligonükleotit, test tüpünde sentezlenen, genellikle 50 nükleotidden daha kısa, kısa, tek sarmallı bir DNA molekülüdür. Optimum koşullarda, eğer oligonükleotit ikinci molekülle tamamen baz çiftli bir yapı oluşturursa, başka bir DNA molekülüyle hibridize olur. Bazlardaki tek bir uyumsuzluk (oligonükleotid içinde bir baz çifti oluşturmayan tek bir konum) varsa, o zaman hibridizasyon gerçekleşmez (Şekil 3.8). Oligonükleotit hibridizasyonu bu nedenle bir SNP'nin iki aleli arasında ayrım yapabilir. 35

36. SNP • Oligonükleotit hibridizasyon analizi ile SNP tiplemesinin temeli. • Son derece sıkı hibritleşme koşulları altında, sadece oligonükleotit, hedef DNA ile tamamen baz çiftli bir yapı oluşturabildiğinde, kararlı bir hibrit oluşur. Tek bir uyumsuzluk varsa, o zaman melez oluşmaz. Bu sıkılık seviyesine ulaşmak için, inkübasyon sıcaklığının oligonükleotidin erime sıcaklığının veya Tm'nin hemen altında olması gerekir. Tm'nin üzerindeki sıcaklıklarda, tamamen baz çiftli hibrit bile kararsızdır. Tm'nin 5°C'den daha fazla altında, uyumsuz hibritler kararlı olabilir. • Şekilde gösterilen oligonükleotit için Tm, yaklaşık 58°C olacaktır. Tm (Celsius derece cinsinden), Tm = (4 × G ve C nükleotit sayısı) + (2 × A ve T nükleotid sayısı) formülünden hesaplanır. Bu formül, 15-30 nükleotit uzunluğundaki oligonükleotitler için Tm'nin kabaca bir hesaplamasıdır. 36

37. Oligonükleotit hibridizasyonuna dayalı çeşitli SNP tiplendirme stratejileri tasarlanmıştır, bunlardan ikisi: 1- DNA çip teknolojisi 2- Solüsyon hibridizasyon tekniği 3- Oligonükleotit ligasyon deneyi 4- ARMS testi: Amplifikasyon refrakter mutasyon sistemi 37

38. DNA çip teknolojisi • DNA çip teknolojisi, yüksek yoğunluklu bir dizide birçok farklı oligonükleotidi taşıyan 2 cm2veya daha küçük bir cam veya silikon yüzey kullanır. • Test edilecek DNA bir flüoresan işaretleyici ile etiketlenir ve çipin yüzeyine pipetlenir. Floresan mikroskobu ile çip incelenerek hibridizasyon tespit edilir. • Floresan sinyalinin yayıldığı konumlar, hangi oligonükleotitlerin test DNA'sı ile hibritleştiğini gösterir (Şekil 3.9). Hibridizasyon, test DNA'sındaki bir oligonükleotid ile onun tamamlayıcı sekansı arasında tam bir eşleşme gerektirir ve bu nedenle testte bir SNP'nin iki versiyonundan hangisinin bulunduğunu gösterir. Oligonükleotidler, çipin yüzeyinde bir dizi halinde sabitlenir. İşaretli DNA uygulanır ve hibridizasyonun meydana geldiği konumlar, lazer tarama veya floresan konfokal mikroskopi ile belirlenir. • 2 cm2'lik bir çip, eğer çip her bir SNP'nin her iki aleli için oligonükleotitler taşıyorsa, tek bir deneyde 300.000 SNP tipleyebilir. 38

39. Çözelti hibridizasyonu • Çözelti hibridizasyon tekniği mikrotiter tepsisinin kuyularında gerçekleştirilir. Hibritleşmemiş, tek iplikli DNA ile bir oligonükleotid test DNA'sına hibritleştiğinde ortaya çıkan çift iplikli ürün arasında ayrım yapabilen bir tespit sistemi kullanılır. En popüler saptama sistemi, gerçek zamanlı PCR sırasında ürün oluşumunu takip etmek için bir raportör probun kullanılma şeklinin temeli olarak karşılaştığımız boya söndürmeyi (quencher). • SNP tiplemesinde, floresan boya, oligonükleotidin bir ucuna ve söndürme bileşiği diğer ucuna eklenir. Oligonükleotit ile test DNA'sı arasındaki hibridizasyon, floresan sinyalinin üretilmesiyle gösterilir. Bu bağlamda kullanıldığında, boya söndürme tekniğine bazen moleküler beacon adı verilir. 39

40. SNP belirleme yöntemleri-devamı • 3 ve 4 numaralı SNP belirleme yöntemleri, SNP ile uyumsuzluğu 5'- veya 3' ucunda meydana gelen bir oligonükleotit kullanır. Uygun koşullar altında, bu tip bir oligonükleotit, kısa, baz çifti olmayan bir kuyrukla uyumsuz şablon DNA'ya hibridize olacaktır (Şekil 3.10A). 40

41. Oligonükleotid ligasyon deneyi (OLA) • Birbirine bitişik bağlanan iki oligonükleotit kullanır ve bu oligonükleotitlerden birinin 3' ucu tam olarak SNP'de konumlanmıştır. • Bu oligonükleotit, şablon DNA'da SNP'nin bir versiyonu mevcutsa tamamen baz çiftli bir yapı oluşturacaktır ve bu meydana geldiğinde, oligonükleotid eşine bağlanabilir (Şekil 3.10B). İncelenmekte olan DNA, SNP'nin diğer alelini içeriyorsa, test oligonükleotidinin 3'-nükleotidi şablona bağlanmaz ve hiçbir ligasyon meydana gelmez. Bu nedenle alel, ligasyon ürününün sentezlenip sentezlenmediğini belirleyerek SNP tiplendirilir. • Tek bir SNP belirleniyorsa, ligasyon ürününün oluşumu, yukarıda STR tiplendirmesi için açıklandığı gibi, reaksiyon sonrası karışımın bir kılcal elektroforez sisteminde çalıştırılmasıyla belirlenebilir. 41

42. ARMS testi Amplifikasyon refrakter mutasyon sisteminde veya ARMS testinde; Test oligonükleotidi, bir çift PCR primerinden biridir. Test primerinin 3'- nükleotidi SNP'ye bağlanırsa, Taq polimeraz tarafından uzatılabilir ve PCR gerçekleşebilir, ancak SNP'nin alternatif versiyonu mevcut olduğu için tavlanmazsa, o zaman PCR ürünü oluşturulmaz (Şekil 3.10C). 42

43. 3.3. GENETİK HARİTALAMANIN TEMELLERİ • haritalama tekniklerinin tümü, Gregor Mendel tarafından on dokuzuncu yüzyılın ortalarında yapılan genetik alanındaki ufuk açıcı keşiflerden kaynaklanan genetik bağlantıya dayanmaktadır. Kalıtımın temelleri ve bağlantının keşfi Kısmi bağlantı,mayoz sırasında kromozomların davranışı ile açıklanır. Kısmi bağlantıdan genetik haritalamaya 43

44. Katılımın temelleri-homozigot ve heterozigotluk Mendel, burada gösterildiği gibi, biri mor veya beyaz çiçek rengi olan bezelye bitkilerinde yedi çift zıt özellik inceledi. (A) Saf üreyen bitkiler her zaman ebeveyn rengine sahip çiçekler verir. Bu bitkiler, burada mor çiçekler için VV ve beyaz çiçekler için WW ile gösterilen, her biri bir çift aynı alele sahip olan homozigotlardır. (B) İki saf üreyen bitki çaprazlandığında, F1 neslinde fenotiplerden sadece biri görülür. Mendel, F1 bitkilerinin genotipinin heterozigot VW olduğu sonucuna vardı, bu nedenle V baskın alel ve W resesif aleldir. 44

45. Katılımın temelleri “eksik dominans”/ “ko-dominans” (A) Karanfillerde çiçek renginin eksik baskınlığı. (B) M ve N kan grubu alellerinin eş-baskınlığı. 45

46. Mendel Yasaları • Mendel, baskınlık ve çekiniklik özelliklerini keşfetmesinin yanı sıra, başka deneyler de yaparak iki temel yasayı buldu: Alleller rastgele dağılır • eğer ebeveynin alelleri A ve a ise, o zaman F1 neslinin bir üyesi, aynı şans oranıyla A veya a’yı alma şansına sahiptir. Allel çiftleri bağımsız olarak ayrılır • A geninin alelleri kalıtımı, B genin alellerinin kalıtımından bağımsızdır 46

47. Kısmi bağlantı,mayoz sırasında kromozomların davranışı ile açıklanır • Kromozomlar bütün birimler olarak kalıtılır, bu nedenle bazı gen çiftlerinin alellerinin aynı kromozom üzerinde olduğu için birlikte kalıtılacağı düşünülmüştür (genetik bağlantı prensibi). Ancak, bu durumdan sapmalar da vardır. • Aynı kromozomdaki genler bağlantı göstermelidir. A ve B genleri aynı kromozom üzerindedir ve bu nedenle birlikte kalıtsal olmalıdır. Bu nedenle Mendel’in ikinci yasası A ve B'nin kalıtımı için geçerli olmamalıdır. Gen C farklı bir kromozom üzerindedir, bu nedenle ikinci yasa A ve C veya B ve C'nin kalıtsallığı için geçerli olacaktır. Mendel bağlantı keşfetmedi çünkü çalıştığı yedi genin her biri farklı bir bezelye kromozomunda konumlanmaktaydı. 47

48. Kısmi bağlantı,mayoz sırasında kromozomların davranışı ile açıklanır 48

49. Krossing over ın keşfi ve kısmi bağlantının açıklanışı (Morgan-Drosophila melanogester ile çaprazlama deneyi) 49

50. Kısmi bağlantıdan genetik haritalamaya • Morgan, mayoz sırasında krossing over ile kısmi bağlantının açıklanabileceğini anladıktan sonra, bir kromozom üzerinde genlerin göreceli (nispi) pozisyonlarını eşleştirmeyi başarmıştır. • Esas çalışma lisans öğrencisi Arthur Sturtevant tarafından yapıldı. • Krossing over rastgele meydana gelir. Bu varsayıma göre; birbirine yakın olan iki gen arasında krossing over olma olasılığı birbirinden daha uzak olan iki gene kıyasla daha düşüktür. • Bu nedenle rekombinasyon frekansı, iki gen arasındaki mesafenin bir ölçüsüdür. Farklı gen çiftleri için rekombinasyon frekansları üzerine çalışıyorsanız, kromozom üzerindeki göreceli pozisyonlarının bir haritasını oluşturabilirsiniz. 50