Laboratórna diagnostika očkovaním preventabilných ochorení

1. Nováková, E.: Laboratórna diagnostika očkovaním preventabilných ochorení NRC HI, RÚVZ v Žiline Ústav mikrobiológie a imunológie JLF UK v Martine Vakcinačný deň SR Žilina 27.9.2008

2. Priamy dôkaz vyvolávateľa • - baktérie v odobratej vzorke z miesta momentálneho výskytu - mikroskopicky (tetanus) - kultivačne (diftéria, pertussis) - dôkaz antigénu (v CSM ) - dôkaz NK (PCR – M. tbc,)

3. Priamy dôkaz vyvolávateľa - 2 vírusy zo vzorky odobratej z miesta výskytu • elektronová mikroskopia • imunofluorescenčná mikroskopia • dôkaz antigénu (rotavírus), HIT VNT • dôkaz NK (HPV zo steru krčka maternice) - Izolácia vírusu - pomnoženie (tkanivové kultúry, kuracie embryo, bunkové kultúry) - identifikácia (CPE, mikroskopia, IFA, dôkaz antigénu HIT, VNT)

4. Nepriamy dôkaz vyvolávateľa • Dôkaz protilátok v sére pacienta sérologickými reakciami: • Antigén + protilátka • celkové protilátky – 2 vzorky s intervalom 14 dní s dôkazom signifikantného vzostupu geometrického titra protilátok • protilátky typu IgM, IgG, IgA a ich dynamiky

6. BCG – Mycobacterium tbc • BCG - Bacillus Calmette Guérin - očkovanie kmeňom Mycobacterium bovis - skrížená imunita s Mycobacterium tbc. • priama diagnostika ochorenia (v centrách -- mikroskopicky (predbežná) -- kultivačne 6-9 tyždňov -- PCR skrátenie diagnostiky

7. BCG – Mycobacterium tbc Stanovenie špecifickej imunity • určenie úrovne individuálnej imunity (po očkovaní) • odhalenie latentnej infekcie (pred imunosupresívnou terapiou) in vivo Mantoux in vitro IGRA (Quantiferon)

8. IGRA – interferon gama release assayQuantiferon TB– in vitro test na stanovenie špecifickej bunkami sprostredkovanej imunity • metóda určená na detekciu ochorenia a monitorovanie • in vitro stanovenie aktivity CMI v plnej krvi

10. Bežný postup pri vyhľadávaní latentnej tbc infekcie • Mantoux – in vivo test na stanovenie bunkovej špecifickej odpovede po expozícii antigénu PPD (spoločný pre M.tbc aj BCG) • - záťaž antigénom v teréne imunodeficitných pacientov • - možná anergia • - pamäťové bunky po BCG vakcinácii, • - nízka špecificita, nízka senzitivita, • - boostrovanie PPD antigénom

11. Iná možnosť – dôkaz bunkovej imunity in vitro • Quantiferon / IGRA • in vitro testovanie špecifickej imunity • po expozícii plnej krvi pacienta antigénom špecifickým pre M. tbc • budú stimulovať len špecifické pamäťové bunky po kontakte s M.tbc antigénmi • bez skríženej reakcie s antigénmi BCG vakcíny • antigén nie je podaný pacientom – vylúčenie rizika expozície u imunosuprimovaných • antigén neboostruje pamäťové bunky pacienta

12. Interpretácia: Skúmavka s krvou pacienta a M.tbc antigénom Negat kontrolka – vylúči nešpecifickú sekréciu (napr. po liečbe) Pozit.kontrolka – ukáže schopnosť reagovať (negat. u imunokompromitovaných alebo po terapii) latentna nešpecif pozit pozit negat negat negat pozit negat negat pozit pozit pozit negat negat negat . falošne

13. Mantoux: in vivo reagujú pamäťové bb po BCG aj po M.tbc. stimulácii aplikácia PPD i.d. zápal s induráciou v mieste vpichu Quantiferon: in vitro pamäťové bb po M.tbc infekcii stimulované in vitro sekrécia cytokínov dôkaz: ELISA Porovnanie

14. Corynebacterium diphtheriaezáškrt – diftéria NRC – ÚVZ Košice • Corynebacterium diphteriae - gram pozitívna palička. • Kultivačné vyšetrenie – je dobré upozorniť laboratórium • Toxigénny kmeň - toxigenicitu kmeň získa prostredníctvom bakteriofága, nie všetky kmene sú toxigénne • Testovanie toxigenity kmeňa - Elekov test imunodifúzie in vitro

15. Diftéria - imunita • protektívna antitoxická imunita – stanovenie hladiny antitoxických protilátok IgG (metóda ELISA) – je dôležité udržovať antitoxickú imunitu na dostatočnej úrovni • -- Schickov kožný test - dôkaz neutralizujúcich protilátok - i.d. podaním difterického toxínu

16. Tetanus • G + sporulujúca anaeróbna palička • Mimo tela prežíva roky ako odolná spóra • V tele za anaeróbnych podmienok germinuje na vitálnu baktériu produkujúcu toxín • diagnostika – obvykle stačí klinická • mikrobiologicky – typický obraz v mikroskopickom preparáte po germinácii spóry • kultivačne – anaeróbna kultivácia – klinicky bezvýznamná • dôkaz toxínu – laboratórne na laboratórnych myšiach • alebo imunoanalýzou (klinicky bezvýznamná)

17. Antitoxická imunita – dôkazom antitoxických protilátokDôležité je udržiavať dostatočnú hladinu antitoxickej imunity Po prežitom ochorení neexistuje špecifická imunita – nie je dostatočný antigénny stimul - preočkovať

18. Pertussis - čierny kašeľ • Bordetella pertussis - gram negatívna palička • Diagnostika – priama – zriedkavo požadovaná - veľmi náročná (odber, diagnostické pôdy, dlhodobá kultivácia) -- nepriama – aglutinačné protilátky z 2 odberov z odstupom 14 dní alebo --špecifické IgG, IgM , IgA

19. Čierny kašeľ • stanovenie imunity ELISA IgG NRC ÚVZ Banská Bystrica Konfirmačné vyšetrenie PCR B

20. Hemofilové invázne ochorenia • Haemophilus influenzae typ b – • Očkovanie nezabráni -- infekciám horných dýchacích ciest, -- prítomnosti H.influenzae na sliznici -- ochoreniam opúzdranými kmeňmi typu a, c, d, f • Diagnostika – priama – kultivačne z HK (invázne ochorenia) a CSM, punktát tkaniva -- mikroskopicky z CSM, -- dôkaz antigénu z • !!!nikdy neodoberať vzorku pri epiglotitíde!!!

21. NRC RÚVZ Žilina Dôkaz protilátok nemá diagnostický význam stanovenie antiinfekčnej imunity – dôkaz špecifických protilátok metódou ELISA

22. Pneumokokové invázne ochorenia • Priama diagnostika – kultivačne krv na hemokultiváciu, CSM, aspirát z pľúc Streptococcus pneumoniae • Dôkaz existencie púzdra – podľa rastových charakteristík, Burriho metóda negatívneho farbenia • Určenie sérotypu – polysacharidové púzdro (96 typov) – nepriama aglutinácia špecifickými sérami – dostupná – klinicky nevýznamná (epidemiologicky významná)

23. Dôkaz protilátok proti Str.pneumoniae • Stanovenie špecifických protilátok – (proti 23 antigénom) – ELISA – postvakcinačné, postinfekčné protilátky postvakcinačné – typovo špecifické • chránia predovšetkým pred inváznymi ochoreniami (meningitída, pneumónia) Str.pneumoniae daného sérotypu • významný je vplyv kolektívnej imunity na zníženie používania antibiotík

24. MMR – osýpky, mumps, ružienka • diagnostika v minulosti klinická laboratórna -- sérologický dôkaz IgM protilátok – – virologická diagnostika vírusu Interpretácia výsledkov – špecificita použitých testov, -- nešpecifická stimulácia protilátky produkujúcich buniek (u tehotných a v priebehu iných infekcií -- laboratórny výsledok je pomocným U očkovaných a pri kolektívnej imunite je významný klinický obraz a epidemiologická anamnéza

25. NRC ÚVZ Bratislava

26. Skríning intrauterinnej infekcie vírusom rubeolly • teratogénny účinok vírusu pri primoinfekcii tehotnej - Greggov sy • vyšetrenie IgM protilátok - pozitivita = akútne ochorenie = včasné Ab po očkovaní • možnosť nešpecifickej polyklonálnej aktivácie a pozitivity testu u tehotných • prítomnosť protektívnych IgG v populácii po očkovaní

27. Poliomyelitída NRC ÚVZ Bratislava Klinická diagnostika + konfirmácia izoláciou vírusu • Diagnostika – priama zo stolice (nie výter) – -- nepriama – dôkaz postvakcinačných alebo postinfekčných protilátok (KFT, VN T)

29. Hepatitída A – stanovenie protilátok anti HAV total (IgM+IgG) -- anti HAV IgM IgM = akútné ochorenie alebo po 1. dávke OL

30. Hepatitída B – antiHBs – po očkovaní aj po ochorení -- po ochorení aj anti HBc total -- ochorenie HBsAg, HBcIgM, HBeAg – aktívna infekcia

31. Ďalšie typy očkovania • Kliešťová encefalitída – diagnostika nepriama ELISA IgM -- IgG – prekonané ochorenie alebo po očkovaní • Rotavírusová enteritída -- diagnostika ochorenia priama Latex aglutinácia zo stolice -- antiinfekčná a postvakcinačná sa nestanovuje

32. Očkovanie proti chrípke NRC ÚVZ Bratislav • V. chrípky - typ A alebo B v období epidémie je diagnstika klinická dôkaz priamy pre epidemiologické účely a identifikáciu vírusu – virologická diagnostika – odber – výplach z nazofaryngu do transportného média dôkaz nepriamy – IgG, IgM a IgA protilátky – špecifické pre daný typ chríkového vírusu

33. HPV • infekcia krčku maternice HPV – prekanceróza -- diagnostika priama -- ster z krčka maternice -- histologické vyšetrenie PAP smear • dôkaz prítomnosti LR alebo HR HPV – genetickou sondou (alebo PCR) • Existencia viacerých typov – najviac 16 a 18 (podľa zahraničných štúdií) • Význam vyšetrenia – identifikácia infekcie bez klinických prejavov = dôležitosť preventívnych vyšetrení

34. Stanovenie individuálnej imunity • Prítomnosť špecifických protilátok • po vymiznutí – existencia pamäťových buniek • stačí booster dávka • stanovenie existencie anamnestickej odpovede – ELISPOT • pri antitoxickej imunite (dostatočná hladina)

35. ELISPOT • metóda používaná na detekciu sekrécie cytokínov (napr. pri vývoji vakcín) • stanovuje aktivitu špecifických buniek po expozícii antigénu in vitro

36. + špecifický antigén = = produkcia cytokínov ich stanovenie

38. Ďakujem za pozornosť