slide1 l.
Download
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
Autoassemblage de macromolécules biologiques via des poly(pyrroles) et/ou des nanotubes de carbone fonctionnalisés. Th PowerPoint Presentation
Download Presentation
Autoassemblage de macromolécules biologiques via des poly(pyrroles) et/ou des nanotubes de carbone fonctionnalisés. Th

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 39

Autoassemblage de macromolécules biologiques via des poly(pyrroles) et/ou des nanotubes de carbone fonctionnalisés. Th - PowerPoint PPT Presentation


  • 284 Views
  • Uploaded on

Autoassemblage de macromolécules biologiques via des poly(pyrroles) et/ou des nanotubes de carbone fonctionnalisés. Thèse de doctorat Jessica BAUR. Sommaire. Introduction Le poly(pyrrole-NTA) : une plateforme polyvalente pour l’immobilisation de biomolécules

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about 'Autoassemblage de macromolécules biologiques via des poly(pyrroles) et/ou des nanotubes de carbone fonctionnalisés. Th' - Thomas


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
slide1

Autoassemblage de macromolécules

biologiques via des poly(pyrroles) et/ou des

nanotubes de carbone fonctionnalisés.

Thèse de doctorat

Jessica BAUR

slide2

Sommaire

Introduction

Le poly(pyrrole-NTA) : une plateforme polyvalente pour l’immobilisation de biomolécules

Les nanotubes de carbone et leur incorporation dans les architectures biomoléculaires

Conclusions et perspectives

Remerciements

1

slide3

Récepteur biologique

SIGNAL

Film

Transducteur

Analytes

Electrochimique

Gravimétrique

Oligo-sonde / oligo-cible

Anticorps / antigène

Substrat / enzyme …

Optique

Thermique…

Introduction générale

Les biocapteurs

  • Applications : sciences de la vie (agroalimentaire, médecine…), environnement (pollution), bioterrorisme
  • Etape déterminante : immobilisation du biorécepteur sur le transducteur
    • → poly(pyrroles) électrogénérés = versatilité, stabilité, conduction, adressage électrochimique
  • Challenges : augmenter les performances (sensibilité, spécificité, stabilité…) et diminuer la taille
    • → architectures tridimensionnelles à base de nanotubes de carbone

2

slide4

S

S

S

S

S

S

S

S

P

P

P

P

P

P

P

P

S

P

S

P

S

P

S

P

adsorption

greffage chimique

électropolymérisation

Introduction générale

Les polymères électrogénérés

3

slide5

ancrage par interactions affines

S

P

S

P

S

S

S

S

P

P

P

P

S

P

encapsulation

Introduction générale

Les polymères électrogénérés

systèmes affins les + utilisés :

avidine/biotine

adamantane/b-cyclodextrine

NTA/Cu2+/histidine

4

slide6

Single-Walled Carbon Nanotubes

SWCNTs

Multi-Walled Carbon Nanotubes

MWCNTs

200 nm

200 nm

Introduction générale

Les nanotubes de carbone (CNTs) : présentation

  • → Structure : feuillet de graphène enroulé « sans couture ».
  • → Les deux types de CNTs :

5

slide7

Introduction générale

Les nanotubes de carbone (CNTs) : présentation

  • → Propriétés :
  • Conductivités thermique et électrique, résistance mécanique, légèreté.
  • avantage pour les biocapteurs ou les biopiles : haute surface spécifique (1000 m2.g-1)
  • → Inconvénients :
  • purification difficile et/ou coûteuse (carbone amorphe, graphite, particules de catalyseur…)
  • solubilisation : mise au point d’un pré-traitement[1]

sans prétraitement, SWCNTs dans le THF

avec prétraitement, SWCNTs dans le THF

6

[1] R. Haddad et al. Analyst 2009, 134, 2412-2418.

slide8

Introduction générale

Les nanotubes de carbone (CNTs) : fonctionnalisation

  • → Quelques méthodes :

CNTs

Fonctionnalisation non-covalente

Fonctionnalisation

des défauts

électropolymérisation

Fonctionnalisation covalente

  • → Techniques utilisées :
  • - fonctionnalisation non-covalente par p-stacking pour l’immobilisation de la GOX
  • - combinaison CNTs/poly(pyrrole) pour l’encapsulation d’une hydrogénase NiFe

7

slide9

Sommaire

Introduction

Le poly(pyrrole-NTA) : une plateforme polyvalente pour l’immobilisation de biomolécules

  • Présentation du poly(pyrrole-NTA) et généralités
  • Elaboration d’un capteur à ADN pour la détection du VIH
  • Mise en évidence d’une nouvelle interaction

Les nanotubes de carbone et leur incorporation dans les architectures biomoléculaires

Conclusions et perspectives

Remerciements

8

slide10

Le pyrrole-NTA : généralités

→ Structure[2]

acide nitrilotriacétique = NTA

→ L’interaction NTA/Cu2+/histidine

Biomolécules marquées avec des histidines immobilisées :

→ l’ADN du VIH

capteur à ADN pour la détection du VIH

→ la glucose oxydase (enzyme modèle)

biocapteur enzymatique pour la détection du glucose

9

[2] N. Haddour et al. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 5752-5753.

slide11

Formation du (poly)pyrrole :

→ augmentation du signal électroactif réversible du poly(pyrrole)

Signal irréversible du motif pyrrole

→ Etapes pour l’immobilisation de biomolécules histidinylées

GOX

→ polymérisation du pyrrole-NTA

→ incubation avec Cu2+ (10-2 mol.L-1, 20 min)

→ incubation avec biomolécule marquée avec des histidines (0,5 mg.mL-1 ; 30 min)

GOX

électrode

Le pyrrole-NTA : généralités

→ Etude électrochimique

[pyrrole-NTA] = 5.10-3 mol.L-1, CH3CN + LiClO4 (0,1 mol.L-1), électrode Pt (Ø = 5 mm), v = 100 mV.s-1

10

slide12

FITC

électrode

électrode

électrode

électrode

Elaboration d’un capteur à ADN pour la détection du VIH

→ Caractérisation qualitative de l’interaction NTA/Cu2+/His-ADNsonde

clichés de microscopie à fluorescence obtenus après incubation avec avidine-FITC et rinçage,

capteur à ADN complet

électrode recouverte de Ppyr-NTA

après ancrage

de His-ADNsonde

sur le Ppyr-NTA

électrode nue

séquence His-ADNsonde :

5′-NH2-(His)5-GAGACCATCAATGAGGAAGCTG-3′

11

slide13

Equation de Sauerbrey :

Elaboration d’un capteur à ADN pour la détection du VIH

→ Caractérisation quantitative de l’interaction NTA/Cu2+/His-ADNsonde/ADNcible

microbalance à quartz (QCM), quartz d’or modifiés par le poly(pyrrole-NTA)/Cu2+.

recouvrement surface avec His-ADNsonde : 94 %

pourcentage d’hybridation : 45 %

angle surface-duplex d’ADN : 80 °

(a) His-ADNsonde, (b) B-ADNcible et (c) avidine

solutions dans le PBS (0,05 mol.L-1, pH = 7, NaCl 0,5 mol.L-1) ; débit : 50 µL.min-1

(a) : 0,01 mg.mL-1, (b) : 0,01 mg.mL-1 et (c) : 0,5 mg.mL-1

12

slide14

I

2 DI

Ic

2 DE

E

Ec

résistance trop importante : utiliser une sonde neutre

représentation utilisée : plan complexe de Nyquist

Circuit électrique équivalent modèle

choix de la sonde électrochimique :

1) Fe(CN)63/4-(4.10-3 mol.L-1), Eapp = OCP / ECS et DE = 5 mV rms.

W

RTC

Rel

ZW

d

CDC

- Im(Z) (W)

Rel

RTC

Rd

Re(Z) (W)

2) hydroquinone (10-3 mol.L-1), Eapp = 0,4 V / ECS et DE = 5 mV rms.

Elaboration d’un capteur à ADN pour la détection du VIH

→ Etude du capteur à ADN par spectroscopie d’impédance électrochimique (EIS)

avantages : décomposition du processus électrochimique global en processus élémentaires et cible non marquée

principe de la spectroscopie d’impédance électrochimique :

gamme de fréquences : 0,1 Hz à 500 kHz.

13

slide15

Ppyr-NTA

Ppyr-NTA

Elaboration d’un capteur à ADN pour la détection du VIH

→ Etude du capteur à ADN par spectroscopie d’impédance électrochimique

[hydroquinone] = 10-3 mol.L-1, Eapp = 0,4 V / ECS, DE = 5 mV rms, électrode CV (Ø = 3 mm) et gamme de fréquences : 0,1 Hz à 500 kHz.

Ancrage de His-ADNsonde sur le Ppyr-NTA :

Détection du phénomène d’hybridation de l’ADN :

demi-cercle → RTC

DRTC plus importante avec l’ADN complémentaire

Solutions contenant 10-8 mol.L-1 d’ADN complémentaire ou non-complémentaire

14

J. Baur et al. Anal. Chem. 2010, 82, 1066-1072.

slide16

Elaboration d’un capteur à ADN pour la détection du VIH

→ Etude du capteur à ADN par spectroscopie d’impédance électrochimique

détermination de la limite de détection du capteur à ADN

[hydroquinone] = 10-3 mol.L-1, Eapp = 0,4 V / ECS, DE = 5 mV rms, électrode CV (Ø = 3 mm) et gamme de fréquences : 0,1 Hz à 500 kHz.

DRTC augmente avec [ADNcible]

[ADNcible] croissantes entre (a) 10-17 et (f) 3,1.10-6 mol.L-1

courbe d’étalonnage : DRTC = f([ADNcible]).

gamme de linéarité : 10-15 à 10-8 mol.L-1

pente = 89,8 W.unité log-1

limite de détection : 10-15 mol.L-1

15

J. Baur et al. Anal. Chem. 2010, 82, 1066-1072.

slide17

Elaboration d’un capteur à ADN pour la détection du VIH

→ Etude du capteur à ADN par conductimétrie

courbe d’étalonnage pour f = 3 Hz

[hydroquinone] = 10-3 mol.L-1, Eapp = 0,4 V / ECS, DE = 5 mV rms, électrode CV (Ø = 3 mm) et gamme de fréquences : 0,1 Hz à 500 kHz.

DZ3Hz augmente avec [ADNcible]

courbe d’étalonnage : DZ3Hz = f([ADNcible]).

gamme de linéarité : 10-15 à 10-8 mol.L-1

pente = 82,8 W.unité log-1

limite de détection : 10-15 mol.L-1

16

J. Baur et al. Anal. Chem. 2010, 82, 1066-1072.

slide18

Démonstration qualitative de cette nouvelle interaction par microscopie à fluorescence :

cliché obtenus après incubations avec GOX-B et l’avidine-FITC puis rinçage,

Rappel : pas d’ancrage de l’avidine-FITC sur les électrodes

ni sur le Ppyr-NTA/Cu2+

FITC

NTA/Cu2+/(histidine)2

NTA/Cu2+/(biotine)2

électrode

GOX

  • interaction entre l’atome S de la biotine
  • et l’ion Cu2+ démontrée en 1970[2]

[2] R. Griesser et al. Biochemistry 1970, 9, 3285-3293.

Mise en évidence d’une nouvelle interaction entre

NTA/Cu2+ et la molécule biotine

  • → Interaction NTA/Cu2+/histidine performante pour l’immobilisation de l’ADN
  • → Soupçons d’interaction entre le polymère et la biotine

17

slide19

Ppyr-NTA

Mise en évidence d’une nouvelle interaction NTA/Cu2+/biotine

  • → Etude de l’ancrage de l’ADN par spectroscopie d’impédance électrochimique :

Ancrage de B-ADNsonde sur le Ppyr-NTA :

Phénomènes d’ancrage et d’hybridation confirmés

Comparaison des deux systèmes délicate (interaction et ADN différents)

Utilisation d’enzyme (GOX)

pour comparaison

Détection du phénomène d’hybridation de l’ADN :

[hydroquinone] = 10-3 mol.L-1, Eapp = 0,4 V / ECS, DE = 5 mV rms, électrode CV (Ø = 3 mm) et gamme de fréquences : 0,1 Hz à 500 kHz.

18

J. Baur et al. Electrochem. Commun. 2010, 12, 1287-1290.

slide20

électrode

GOX

GOX

GOX

électrode

électrode

Comparaison des résultats obtenus pour l’immobilisation de la glucose oxydase (enzyme modèle)

Courbes typiques cinétique enzymatique :

I = f([glucose])

→ aux faibles [glucose] : partie linéaire initiale = sensibilité de l’électrode

→ aux fortes [glucose] : plateau = Jmax,

saturation de l’enzyme en substrat.

Eapp = 0,6 V / ECS, tampon phosphate (0,1 mol.L-1, pH = 7).

19

slide21

Comparaison des résultats obtenus pour l’immobilisation de la glucose oxydase (enzyme modèle)

référence

Perméabilités : poly(pyrrole-NTA) : Pm = 10-1 cm.s-1 et poly(pyrrole-biotine) : Pm = 10-3 cm.s-1 (facteur 100)

Performances similaires entre les systèmes NTA/Cu2+/histidine et NTA/Cu2+/biotine

Meilleures performances en présence du duplex d’ADN → + d’enzymes immobilisées (ADN agit comme un éventail)

20

[3] S. Cosnier et al. Anal. Chem. 1999, 71, 3692-3697.

slide22

Conclusions 1ère partie : le poly(pyrrole-NTA)

  • Avantages du poly(pyrrole-NTA) :
    • → bonne perméabilité du polymère et faible limite de détection
    • → possibilité d’immobiliser des molécules marquées avec des histidines OU des biotines
    • → adressage électrochimique propre aux polymères électrogénérés
  • Avantages de l’interaction NTA/Cu2+/histidine :
    • → réversibilité de l’interaction NTA/Cu2+/histidine
  • Avantages du nouveau système NTA/Cu2+/biotine :

→ par rapport au système NTA/Cu2+/histidine : disponibilité commerciale des molécules biotinylées

→ par rapport au système classique avidine/biotine : meilleures performances

→ alternative séduisante au système avidine/biotine

21

slide23

Sommaire

Introduction

Le poly(pyrrole-NTA) : une plateforme polyvalente pour l’immobilisation de biomolécules

Les nanotubes de carbone et leur incorporation dans les architectures biomoléculaires

  • Fonctionnalisation multiple de CNTs
  • Combinaison CNTs/poly(pyrrole) pour la connexion d’une réductase

Conclusions et perspectives

Remerciements

22

slide24

électrode

électrode

  • → Procédure :

trempage de l’électrode dans

une solution contenant un ou

des pyrènes fonctionnalisés

5.10-4 mol.L-1 dans le THF

dépôt SWCNTs dispersés

20µL à 0,1 mg.mL-1 dans le THF

séchage

répétition x2

  • → L’interaction CNT/pyrène :
  • → Synthèse de pyrènes fonctionnalisés par des partenaires affins :

Fonctionnalisation multiple des CNTs pour l’immobilisation d’enzymes (GOX)

23

slide25

GOX

GOX

GOX

électrode

électrode

électrode

Fonctionnalisation simple des SWCNTs

  • Système
  • adamantane/b-cyclodextrine
  • Système
  • NTA/Cu2+/histidine
  • Système
  • biotine/avidine/biotine

solutions contenant un des 3 pyrènes (5.10-4 mol.L-1)

Eapp = 0,6 V / ECS, tampon phosphate (0,1 mol.L-1, pH = 7).

24

slide26

référence

Comparaison des résultats obtenus pour la fonctionnalisation simple des SWCNTs

Système adamantane/b-cyclodextrine le plus performant

Gammes de linéarité et seuil de détection similaires entre les systèmes adamantane/b-cyclodextrine et NTA/Cu2+/histidine

Plus mauvais : avidine/biotine → phénomène d’écrantage dû à l’avidine

25

slide27

GOX

GOX

avidine

b-CD-GOX

Cu2+

His-GOX

GOX

GOX

GOX

GOX

B-GOX

Fonctionnalisation multiple des SWCNTs

mélange équimolaire 1/1/1 des 3 pyrènes (5.10-4 mol.L-1)

Eapp = 0,6 V / ECS, tampon phosphate (0,1 mol.L-1, pH = 7).

26

slide28

Fonctionnalisation multiple des SWCNTs

  • → Résultats :
  • → Démonstration possibilité de fonctionnaliser les SWCNTs avec les 3 systèmes affins considérés (NTA/Cu2+/His, avidine/biotine, adamantane/b-CD) par simple trempage.
  • → Applications : détection multienzymatique à activités combinées, détection de plusieurs analytes…

27

slide29

H2ase

=

H2ase

hydrogénase

H2ase

H2ase

H2ase

=

viologène

électrode de carbone vitreux

=

CNTs

H2

H2ase oxydée

MV·+

électrode

e-

H2ase reduite

2 H+

MV2+

Combinaison CNTs/poly(pyrrole) pour la connexion électrique d’une hydrogénase

  • → Combinaison performances CNTs et poly(pyrrole)

site actif

NiFe

  • → L’hydrogènase NiFe de Desulfovibrio fructosovorans pour la bioconversion de l’énergie :
  • Enzyme qui catalyse de façon réversible :
  • H2 = 2 H+ + 2e-
  • capacité double :
  • - transformer H2 en énergie électrique
  • - stocker H2

3 clusters FeS

  • → Mode de fonctionnement pour l’oxydation de H2 (transfert d’électrons indirect) :

28

slide30

H2ase

H2ase

H2ase

H2ase

électrode

viologène = MV2+

(médiateur rédox)

Combinaison CNTs/poly(pyrrole) pour la connexion électrique d’une hydrogénase

  • → Polymère choisi : le poly(pyrrole-viologène)
  • viologène = médiateur pour le transfert électronique entre l’enzyme et l’électrode
  • structure[4] :

→ Immobilisation par encapsulation dans le film de poly(pyrrole-viologène) sur des dépôts de CNTs :

dépôt mélange

H2ase + monomère

dépôt SWCNTs dispersés

électro-

polymérisation

séchage

séchage

électrode

électrode

électrode

électrode

dépôt CNTs : n x 10µL à 0,1 mg.mL-1 dans le THF

mélange H2ase (0,2 mg.mL-1) + pyrrole-MV (4.10-3 mol.L-1) : 10 µL

polymérisation : Eapp = 0,8 V / ECS, H2O + LiClO4 (0,1 mol.L-1).

répétition (n fois)

29

[4] S. Cosnier et al. J. Electroanal. Chem. 1997, 433, 113-119.

slide31

H2ase

H2ase

H2ase

H2ase

H2ase

=

H2ase

hydrogénase

H2ase

électrode

H2ase

H2ase

=

viologène

électrode

=

CNTs

Combinaison CNTs/poly(pyrrole) pour la connexion électrique d’une hydrogénase

  • → Etude sur électrode de carbone vitreux :

Jcat = 17 µA.cm-2

électrode de carbone vitreux

  • → Etude sur électrodes de carbone vitreux modifiées par les CNTs :

MWCNTs

SWCNTs

Jcat = 103 µA.cm-2

Jcat = 301 µA.cm-2

Meilleures performances

avec les MWCNTs

  • quantités d’enzyme et de monomère constantes, dégazage Ar 30 min, H2 30 min puis activation H2ase : Eapp = - 0,8 V / ECS (15 min) dans le tampon phosphate (0,1 mol.L-1, pH = 7) et étude dans la même solution par CV et enfin Ar 15 min puis CV.

30

slide32

200 nm

200 nm

200 nm

200 nm

Combinaison CNTs/poly(pyrrole) pour la connexion électrique d’une hydrogénase

  • → Caractérisation par microscopie électronique à balayage (MEB) :

SWCNTs

MWCNTs

avant polymérisation

après polymérisation

Surface « lissée » avec les SWCNTs

Conservation de la porosité avec les MWCNTs ↔ meilleures performances

31

slide33

Combinaison CNTs/poly(pyrrole) pour la connexion électrique d’une hydrogénase

  • → Evolution de l’intensité catalytique en fonction de la quantité de MWCNTs :

Partie

linéaire

courbe Jcat = f(quantité MWCNTs) linéaire

entre 10 et 50 µL de MWCNTs déposés

  • quantités d’enzyme et de monomère constantes, seul VMWCNTs change
  • partie anodique des courbes de voltampérométrie cyclique

Probablement dû à : augmentation de la surface spécifique des électrodes due aux MWCNTs,

meilleure perméabilité,

transfert d’électrons facilité du fait d’une meilleure conduction…

32

slide34

Conclusions 2ème partie : les nanotubes de carbone

  • Fonctionnalisation multiple de SWCNTs :
    • → mise en œuvre simple par trempage
    • → possibilité de fonctionnalisation avec 3 systèmes affins différents
  • Combinaison CNTs/poly(pyrrole) pour la connexion électrique d’une hydrogénase
    • → résultats préliminaires mais prometteurs
    • → augmentation du signal obtenu après dépôt de CNTs en général et plus particulièrement avec les MWCNTs
  • Nanotubes de carbone :
    • → augmentation de la surface spécifique des électrodes
    • → augmentation de la conduction et de la perméabilité des films

33

slide35

PERSPECTIVES

  • Poly(pyrrole-NTA) : NTA/Cu2+/biotine
    • → réversibilité,
    • → utiliser dans des biocapteurs (Ab/Ag, ADN…),
    • → taux de recouvrement de surface.
  • CNTs :
    • → architecture multifonctionnelle : applications diverses,
    • → connexion d’une hydrogénase NiFe : optimisation du système.

CONCLUSIONS GENERALES

  • Potentiel des films de poly(pyrrole) et des nanotubes de carbone pour :
    • → augmenter sensibilité et seuil de détection des architectures biomoléculaires
    • → immobilisation de biomolécules en général
    • → réaliser systèmes multifonctionnels
    • → combinaison des deux : amplification des performances

34

slide36

Remerciements

Jury :

Rapporteurs : Dr. Elisabeth Lojou et Pr. Alexander Kuhn

Examinateurs : Dr. Gérard Bidan et Pr. Pierre Gros

Département de Chimie Moléculaire

Equipe BEA :

Directeurs de thèse : Dr. Serge Cosnier et Dr. Michael Holzinger,

Dr. Chantal Gondran, Arielle Le Pellec, Dr. Alan Le Goff, Dr. Karine Gorgy

Permanents et étudiants du DCM

Merci pour votre attention!

35

slide39

Connexion d’une hydrogénase NiFe sur les MWCNTs

  • → Etude de l’évolution du signal de Fe(CN)64- en fonction de la quantité de MWCNTs :

Courbe I(Fe(CN)64-) = f(quantité MWCNTs) linéaire entre 10 et 60 µL de MWCNTs déposés.

Confirme l’hypothèse d’augmentation de la surface spécifique des électrodes due aux MWCNTs

mais ne la valide pas : vérifier absence d’accumulation de Fe(CN)64- dans les MWCNTs.