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RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR. Míriam Onrubia Laura Plaza Patricia Resa. Resonancia Magnética Nuclear. La RMN es un fenómeno que ocurre cuando el núcleo de ciertos átomos inmersos en un campo magnético estático, son expuestos a un segundo campo magnético. 1 H, 13 C, 15 N, 31 P.

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- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
resonancia magn tica nuclear

RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR

Míriam Onrubia Laura Plaza Patricia Resa

resonancia magn tica nuclear2
Resonancia Magnética Nuclear

La RMN es un fenómeno que ocurre cuando el núcleo de ciertos átomos inmersos en un campo magnético estático, son expuestos a un segundo campo magnético.

1H, 13C, 15N, 31P

caracter sticas rmn
Características RMN
  • Uso de muestras no cristalizadas  estructura en solución
  • Posibilidad de aplicar a moléculas sin cristales disponibles.
  • Amplio rango de condiciones experimentales
  • PDB: 16% de proteínas determinadas por RMN
  • Determinación de estructuras de tamaño limitado (35-40 KDa)
mec nica cl sica y cu ntica
Mecánica Clásica y Cuántica

µ = momento magnético dipolar

B = Campo magnético

e = carga del e-

m = massa del átomo o e-

L = Σ momentos angulares

γ = cte giromagnética

M = magnetización

ml = momento angular de spin

mec nica cu ntica
Mecánica Cuántica

Niveles cuánticos de la energía en B0:

DE

ecuaciones de bloch

¶L

T = = M x B

¶t

¶M

¶L

= γ = γT = γ (M x B)

¶t

¶t

Ecuaciones de Bloch
relajaci n14
Relajación

T1

T1: longitudinal relaxation time o spin-lattice relaxation time

T2: transverse relaxation time o spin-spin relaxation time

T2 T1

T2

recoger la se al free induction decay fid
Recoger la señalFree Induction Decay (FID)

Señal

Función de onda para cada sistema spin

Frecuencias

Transformada

de Fourier

determinaci n estructural de prote nas para rmn
Determinación estructural de proteínas para RMN

Proteínas pequeñas (< 10 kDa)

  • RMN bidimensional basada en experimentos de 1H
  • La estructura se puede obtener sin necesidad de enriquecimiento isotópico.

Proteínas pequeñas-medianas (< 20 kDa)

  • Marcaje isotópico (15N i 13C)
  • Experimentos de RMN multidimensionales (3D) de triple resonancia (1H/13C/15N)

Proteínas grandes (> 20 kDa)

  • Marcaje isotópico (15N i 13C) + deuteración (50%-70% 2H)
  • Experimentos de RMN multidimensionales (3D i 4D) de triple resonancia (1H/13C/15N) sofisticados
rmn bidimensional
RMN bidimensional
  • Obtención de los espectros de COSY, TOCSY y NOESY.
  • Asignación : determinar que Aa hay en los espectros
  • Determinación de las distancias entre Aa
  • Reconstrucción 3D
slide19

B0

COSY
  • Identifica los sistemas de spin característicos de los aminoácidos.
  • Permite, por tanto, identificar los aminoácidos.
slide20

C

B

A

HC

HC

HC

HB

HB

HB

HB

HC

HA

HA

HA

HA

CH3-CH2-OH

COSY

90º

90º

t1

t2

t3

t4

TF

90º

90º

TF

90º

90º

TF

90º

90º

TF

slide21

Tiempo de evolución (t1)

Transformada

de Fourier

υ

COSY
slide22

t1

t2

t3

t4

1ª transformada de Fourier

2ª transformada de Fourier

noesy

B0

NOESY
  • Técnica para correlacionar núcleos en el espacio que se encuentran a una distancia menor de 5Å.
  • La diferencia entre los espectros con y sin efecto NOE da lugar al espectro NOESY. Cuanto mayor es el efecto menor es la distancia.
  • Permite la identificación de la posición específica de cada aminoácido en la secuencia.
efecto noe nuclear overhauser effect
Efecto NOE: Nuclear Overhauser Effect

La irradiación sobre un núcleo produce variaciones en la resonancia en los núcleos vecinos.

Condiciones:

  • distancia < 5Å
  • Saturación de la resonancia
rmn bidimensional25
RMN bidimensional
  • Obtención de los espectros de COSY, TOCSY y NOESY.
  • Asignación : determinar que Aa hay en los espectros
  • Determinación de las distancias entre Aa
  • Reconstrucción 3D
asignaci n
Asignación

Identificar tipos de Aa en COSY y TOCSY

Identificar en NOESY los Aa de la secuencia

Desplazamientos químicos en COSY

slide28
Experimento 2D COSY (COrrelation SpectroscopY)

Experiment2D TOCSY (TOtal Correlation SpectroscopY)

O

-HN-CH-C-

CH

γCH3

CH3

CH3

γCH3

Val

βH

αH

NH

Asignación de los sistemas de spin de los Aa

asignaci n de los sistemas de spin de los aa29
Asignación de los sistemas de spin de los Aa

CHbi

O

CHbi+1

O

Ni

Cai

Ci

Ni+1

Cai+1

Ci+1

Ni+2

H

Ha

H

Ha

H

picos correlación TOCSY, COSY

asignaci n de los sistemas de spin de los aa31
Experiment 2D NOESY (Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY)

Ala

O

O

-HN-CH-C-

-HN-CH-C-

CH3

CH

gCH3

gCH3

CH3

CH3

Val

bH

aH

bH

NH

aH

NH

Asignación de los sistemas de spin de los Aa
y al final de la asignaci n

H-K1-F2-I3-V4-F5-F6-I7-K8-F9-K10-OH

2D COSY

2D TOCSY

F

F

F

F

I V F

Asignación secuencial

2D NOESY

K

K

K

K F K

I

I

8 9 10

3 4 5

V

I V F

F I K

3 4 5 6 7 8

F I K

K F I

6 7 8

1 2 3

H-

-OH

K F I V F F I K F K

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

y al final de la asignación ...
rmn bidimensional33
RMN bidimensional
  • Obtención de los espectros de COSY, TOCSY y NOESY.
  • Asignación : determinar que Aa hay en los espectros
  • Determinación de las distancias entre Aa
  • Reconstrucción 3D
determinaci n de las distancias entre aa

H

H

H

H

H

Determinación de las distancias entre Aa

NOE  distancias

NOEs intensos: 1.8 < rHH < 2.8 Å

NOEs medios: 1.8 < rHH < 3.5 Å

NOEs débiles: 1.8 < rHH < 5 Å

rmn bidimensional35
RMN bidimensional
  • Obtención de los espectros de COSY, TOCSY y NOESY.
  • Asignación : determinar que Aa hay en los espectros
  • Determinación de las distancias entre Aa
  • Reconstrucción 3D
reconstrucci n 3d

Estructura 3D

geometría

covalente

Reconstrucción 3D

ángulos diedros

puentes disulfuro

restricciones

experimentales

límites de distancias

entre 1H

Coordenadas

De los átomos de la

proteína

Secuencia

proteína

Longitudes y

ángulos de enlace

quiralidad,

planaridad

Interacciones no covalentes:

van der Waals, electrostáticas, enlaces d’H

slide39

Estructura de proteínas

dihedro

ángulo

enlace

slide40

Estructura de proteínas

dihedro

ángulo

enlace

van der Waals

slide41

Estructura de proteínas

dihedro

ángulo

enlace

+

-

electrostático

van der Waals

slide42

Estructura de proteínas

dihedro

puente de hidrógeno

ángulo

enlace

+

-

electrostático

van der Waals

slide43

NOE

dihedro

ángulo

enlace

Estructura de proteínas

puente de hidrógeno

+

-

electrostático

van der Waals

par metros espectrales con informaci n sobre la estructura secundaria de la prote na
Parámetros espectrales con información sobre la estructura secundaria de la proteína
  • NOE
  • Constantes de acoplamiento (J)
  • Desplazamientos químicos (δ)
  • Velocidades de intercambio H D
  • Coeficientes de temperatura
par metros espectrales con informaci n sobre la estructura secundaria de la prote na47
Parámetros espectrales con información sobre la estructura secundaria de la proteína
  • NOE: La irradiación sobre un núcleo produce variaciones en la resonancia en los núcleos vecinos.

Condiciones:

      • distancia < 5Å
      • Saturación de la resonancia para igualar estados alfa y beta.

Es el método de elucidación de características estructurales en 3D y estereoquímica, usando RMN junto con información de los acoplamientos escalares spin-spin.

par metros espectrales con informaci n sobre la estructura secundaria de la prote na48
Parámetros espectrales con información sobre la estructura secundaria de la proteína
  • Constantes de acoplamiento spin-spin (J):

Las interacciones escalares entre núcleos unidos a través de un pequeño número de enlaces covalentes causan desacoplamiento en las señales de RMN.

Dependen de la geometría de los enlaces que unen los spins nucleares.

par metros espectrales con informaci n sobre la estructura secundaria de la prote na49
Parámetros espectrales con información sobre la estructura secundaria de la proteína
  • Desplazamientos químicos (δ):

Los diferentes protones de una molécula presentan frecuencias de resonancia característica en función de su entorno químico.

par metros espectrales con informaci n sobre la estructura secundaria de la prote na50
Parámetros espectrales con información sobre la estructura secundaria de la proteína
  • Velocidades de intercambio 1H 2H:

5. Coeficientes de temperatura: permite saber si se forman puentes de hidrógeno intramoleculares.

slide51

1.Cita las características más importantes de la técnica RMN y su definición.La RMN es un fenómeno q ocurre cuando el núcleo de ciertos átomos inmersos en un campo magnético estático, son expuestos a un segundo campo magnético. Solo sufren este fenómeno los núcleos que tiene la propiedad llamada SPIN. Núcleos q tienen esta propiedad de spin son 1H, 13C, 15N. Solo los q tienen spin distinto de 0 son detectables por RMN. Características:- Las estructuras a estudiar están en solución, como suelen estar en su medio habitual.- Posibilidad de aplicar a moléculas sin cristales disponibles.- Amplio rango de condiciones experimentales. Esto permite aumentar las posibilidades de estudios comparativos en soluciones de condiciones naturales o desnaturalizantes.- También se pueden estudiar con esta técnica proteínas no solubles: con RMN sólido o con micelas. (para por ejemplo el estudio de prot. Transmembrana).- PDB: 16% de proteínas determinadas por RMN - Determinación de estructuras de tamaño limitado (35-40 KDa)

slide52

2. ¿En que consiste el efecto NOE y que aplicaciones podemos encontrarle?Efecto NOE: la saturación de un sistema spin mediante irradiación producirá variaciones en la señal emitida por los sistemas spin vecinos. Se basa en saturar uno de los sistemas spin de la muestra. Si seguimos irradiando este sistema spin concreto durante un periodo de tiempo más largo, este no puede absorber esta energía de más y la cede a los sistema spin vecinos situados a menos de 5 amstrongs que sí podrán absorber esta energía. Comparando las frecuencias obtenidas habiendo producido o no efecto NOE, podremos deducir que sistemas spin están a 5 amstrongs o menos de distancia. Aplicaciones Experimento NOESY: Nos permite comparar espectros obtenidos habiendo producido el efecto NOE y sin producirlo, de manera que podemos comparar que sistemas de spin quedan afectados por otros sistemas de spin cercanos. Teniendo en cuenta que cada aminoácido tienen un sistema de spin característico, podemos relacionar sistemas spins vecinos separados por enlaces peptídicos (doble enlace), es decir, podemos relacionar aminoácidos vecinos. Esto nos permite conocer la secuencia de una proteína.

slide53
PEM:
  • 1. Señala les opciones correctas:
  • a)      Solo los átomos con sistema de spin diferente de 0 son detectables por RMN.
  • b)      Tienen propiedad de spin los átomos con un número de electrones impar y/o con un número de neutrones impar.
  • c)      Las dos anteriores son correctas.
  • d)      Cualquier tipo de átomo presenta propiedad de spin.
  • e)      Todas las anteriores son correctas.
  • 2. Señala las verdaderas. Sobre RMN (Resonancia Magnético Nuclear)...
  • Una de las principales ventajas del RMN es que no es necesario cristalizar la molécula en estudio.
  • Se pueden hacer RMN en medio sólido.
  • El hecho de que se puedan hacer RMN con micelas, permite el estudio de proteínas transmembrana en un medio similar al que se encuentran en condiciones normales.
  • Uno de los principales inconvenientes es que el tamaño de las proteínas que se pueden estudiar es limitado.
  • a)      1, 2 i 3
  • b)      1 i 3
  • c)      2 i 4
  • d)      4.
  • e)      1, 2, 3 i 4
  • 3.¿Cuál de estas es una característica de la RMN? indica la opción correcta:
  • a)      Las muestras deben estar cristalizadas.
  • b)      Las condiciones experimentales vienen muy detalladas y las condiciones son muy limitadas.
  • c)      Es posible para cualquier tipo de moléculas sin importar el tamaño.
  • d)      Se pueden utilizar micelas para proteínas no solubles.
  • e)      Ninguna de las anteriores es una característica del RMN.
slide54
4. Indica la opción correcta. El RMN unidimensional nos sirve para...
  • a)      Determinar si existe mucho solapamiento entre frecuencias, indicando si debemos hacer RMN 3D.
  • b)      Se usa como indicativo de la calidad que tendrá el estudio en 2D.
  • c)      Indica frecuencias y su posición depende del desplazamiento químico.
  • d)      Todas las anteriores son correctas.
  • e)      Ninguna de las anteriores es correcta.
  • 5. Señala la afirmación incorrecta:
  • a)      Las ecuaciones de Bloch describen la relajación del sistema de spin al dejar de aplicar el segundo campo magnético
  • b)      La frecuencia a la que precesan (giran) los sistemas de spin es completamente irrelevante.
  • c)      El nivel energético en el que se encuentre un átomo sometido a una campo magnético depende del momento angular de spin.
  • d)      El momento magnético bipolar () es directamente proporcional a la carga e inversamente proporcional a la masa.
  • e)      Todas las anteriores son correctas.
  • 6.Señala las verdaderas. Sobre RMN (Ressonància Magnètico Nuclear)...
  • 1.      El experimento COSY permite ver interacciones entre sistemas de spin de distintos Aminoácidos.
  • 2.      El experimento NOESY permite ver interacciones entre sistemas de spin de distintos Aminoácidos.
  • 3.      El experimento COSY permite ver interacciones entre sistemas de spin alejados más de 5 amstrongs.
  • 4.      El experimento NOESY permite ver interacciones entre sistemas de spin separados por un doble enlace.
  • a)      1, 2 i 3
  • b)      1 i 3
  • c)      2 i 4
  • d)      4
  • e)      1, 2, 3 i 4
slide55
7. Indica las verdaderas.
  • a)      Un experimento NOESY proporciona más información que uno COSY.
  • b)      El primer paso del análisis de los resultados de los experimentos de RMN es la asignación ( saber cada sistema de spin a que aminoácido corresponde).
  • c)      Las dos anteriores son correctas.
  • d)      El experimento NOESY nos proporciona las restricciones de distancia entre amnoácidos, de manera que es el que realmente nos da la información sobre la estructura secundaria y terciaria de la proteína.
  • e)      Todas las anteriores son correctas.
  • 8. En el experimento NOESY:
  • 1.      Dado que las proteínas tienen cierto movimiento en solución, las distancias no van a ser números exactos
  • 2.      La lista de distancias obtenidas con un NOESY va a ser esencial para hacer la reconstrucción 3D.
  • 3.      Se utilizan una serie de rangos para definir las distancias entre sistemas de spin, el mínimo de los cuales coincide con la suma de los radios de las fuerzas de Van der Wals.
  • 4.     Cuanto más intenso sea el pico obtenido en un espectro NOESY, más lejos están los aminoácidos implicados.
  • a)     1, 2 i 3
  • b)     1 i 3
  • c)      2 i 4
  • d)     4
  • e)      1, 2, 3 i 4
  • 9. ¿Qué información no va a utilizar el ordenador para hacer la reconstrucción 3D?
  • a)      La geometría covalente (longitudes y ángulos de enlace, quiralidad y polaridad).
  • b)     La secuencia de la proteína.
  • c)Una lista con el número de aminoácidos de cada tipo obtenida con el TOCSY.
  • d)     Las interacciones no covalentes (fuerzas de Van der Wals, enlaces de H...)
  • e)     Los límites de distancias obtenidos con el NOESY.
slide56
10. En cuanto a la asignación en RMN:
  • 1.      Con los espectros de COSY identificaremos qué y cuántos aminoácidos hay en nuestra proteína problema.
  • 2.      El NOESY nos permitirá determinar los aminoácidos vecinos por estructura y por secuencia.
  • 3.      El NOESY es útil para distinguir entre hélices alfa y beta.
  • 4.      Cada aminoácido tiene una distribución de picos característica en un espectro COSY.
  • a)      1, 2 i 3
  • b)      1 i 3
  • c)      2 i 4
  • d)      4.
  • e)      1, 2, 3 i 4