EXPOSE DE BIOLOGIE MOLECULAIRE-4

1. EXPOSE DE BIOLOGIE MOLECULAIRE Groupe 8 THEME 8: PCR en Temps Réel (rt-PCR)

2. MEMBRES DU GROUPE • BELEM Alida • DAH Monique • DELMA Edwige • KABORE Farida • TAPSOBA Tasséré • TOE Océane • YOUGBARE Kevin Professeurs: Pr Théodora M. KONE/ZONHONCON Dr Abel SORGHO

3. PLAN INTRODUCTION I- Le Principe de la PCR en temps réel 1- Le Principe fondamental 2- Les différences entre la PCR conventionnelle et la PCR en temps réel II- Fonctionnement de la PCR en temps réel 1- Les Composants de la PCR en temps réel 2- Les étapes de réalisation la PCR en temps réel 3-Analyse des données de la PCR en temps réel III- Les applications de la PCR en temps réel 1- Le Diagnostiques médicaux

4. PLAN 2- La Recherche en biologie 3- La médecine personnalisé 4-L’agriculture et Biotechnologie 5- La Surveillance environnementale 6- La médecine légale et la criminologie IV- Les avantages et les inconvénients a l’utilisation de la PCR en temps réel 1- Les avantages de l’utilisation de la PCR en temps réel 2-Les inconvénients de l’utilisation de la PCR en temps réel CONCLUSION

5. OBJECTIFS • Etre capable de donner brièvement la définition de la PCR en temps réel • Décrire la technique de la PCR en temps réel • Décrire les étapes de la PCR en temps réel • Citer les outils nécessaire pour la réalisation de la PCR en temps réel • Connaitre les différentes applications de la PCR en temps réel

6. INTRODUCTION La biologie moléculaire est une branche de la biologie se concentrant sur la structure, la fonction et l'interaction des molécules biologiques telles que l'ADN, l'ARN et les protéines. Elle vise à comprendre les mécanismes fondamentaux de la vie. Ainsi dans sa quête elle s’est armée de multiples techniques tel que la PCR classique (en l'anglais : polymerasechainreaction).

7. INTRODUCTION La PCR classique a été découverte par KaryMullis en 1985 et dans son évolution a donné la PCR en temps réel en 1992 avec Russell Higuchi. La PCR en temps réel (PCR rt) représente une avancée majeure dans le domaine de la biologie moléculaire, offrant une méthode précise et efficace pour détecter et quantifier l'ADN ou l'ARN dans un échantillon biologique.

8. INTRODUCTION Cette technique révolutionnaire a permis une meilleure recherche sur les processus biologiques, le diagnostique de maladies et le développement environnementale . Dans cette présentation, nous explorerons les principes fondamentaux de la PCR rt, ses applications dans divers domaines, ainsi que ses avantages et ses limites. En comprenant mieux cette technique moderne, nous pourrons apprécier son impact sur la recherche scientifique et la médecine moderne.

9. I- PRINCIPE DE LA PCR EN TEMPS RÉEL 1- Principe fondamental de la pcr en temps réel La PCR en temps réel, ou PCR rt (pour "real-time"), est une technique de biologie moléculaire utilisée pour amplifier et quantifier simultanément l'ADN. Elle combine les principes de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) classique avec la détection en temps réel des produits de PCR, permettant ainsi de mesurer la quantité d'ADN présent au fur et à mesure de l'amplification grâce a la fluorescence émise par des sondes ou colorants fluorescents.

10. 2- Les différences entre la PCR conventionnelle et la PCR en temps réel La PCR classique et la PCR en temps réel (qPCR) sont deux techniques très similaire de biologie moléculaire utilisées pour amplifier et détecter des fragments d'ADN. Voici les principales différences entre ces deux méthodes : • Détection du produit: Avec la PCR classique, la détection se fait à la fin du cycle d'amplification. Les produits d'amplification sont généralement visualisés par électrophorèse sur gel d'agarose suivi d'une coloration, souvent avec du bromure d'éthidium tandis qu’avec la PCR en temps réel La détection

11. 2- les différences entre la PCR conventionnelle et la PCR en temps réel se fait en temps réel pendant chaque cycle d'amplification grâce à des sondes fluorescentes spécifiques ou des colorants intercalants. Les données sont collectées au fur et à mesure de l'amplification. • Quantification : La PCR classique est essentiellement qualitative ou semi-quantitative. Elle permet de dire si un fragment d'ADN est présent ou non, mais ne permet pas une quantification précise l'ADN initial tandis que La qPCR est quantitative permettant de déterminer la quantité initiale d'ADN avec une grande précision.

12. 2- les différences entre la PCR conventionnelle et la PCR en temps réel avec une grande précision. La quantification est basée sur le cycle seuil (Ct), qui est le point où la fluorescence dépasse un certain seuil. • Sensibilité : la PCR classique est moins sensible que la qPCR, il peut être difficile de détecter de faibles quantités d'ADN cible. En résumé, la PCR classique est utilisé pour des analyses qualitatives, tandis que la qPCR permet une analyse quantitative plus précise en temps réel.

14. II- FONCTIONNEMENT DE LA PCR en temps réel 1-LES COMPOSANTS DE LA PCR EN TEMPS REEL

15. 1-LES COMPOSANTS DE LA PCR EN TEMPS REEL Pour réaliser la PCR en temps réel, plusieurs réactifs et composants sont nécessaires. Voici une liste des principaux : • ADN matrice: Avant la réaction de PCR, l’ADN est extrait à partir de l’échantillon que l’on veut analyser (salive, cheveux, cellules, fossile…). Puis, cet extrait est purifié en ADN, contenant uniquement le fragment d’ADN que l’on souhaite amplifier.

16. 1-LES COMPOSANTS DE LA PCR EN TEMPS REEL • Les amorces :Ce sont des fragments courts d'ADN, capables de s'hybrider de façon spécifique, grâce à la complémentarité des bases, sur l’un des deux brins d'ADN. Les amorces sont choisies de façon à encadrer la séquence d'ADN à amplifier. La taille de ces amorces est généralement d’une vingtaine de désoxyribonucléotides. De plus, les amorces sont en très forte concentration par rapport à celle de l’ADN à amplifier.

18. 1-LES COMPOSANTS DE LA PCR EN TEMPS REEL • Nucléotides (dNTPs) : Les quatre types de bases nucléotidiques (adénine, thymine, cytosine et guanine) nécessaires pour construire de nouveaux brins d'ADN pendant la réaction de PCR. • Taq polymérase : Une enzyme thermorésistante qui synthétise de nouveaux brins d'ADN en ajoutant des nucléotides aux amorces pendant la réaction de PCR.

19. 1-LES COMPOSANTS DE LA PCR EN TEMPS REEL • Tampons de réaction : Les réactifs nécessaires pour maintenir les conditions optimales de la PCR, les tampons de réaction contiennent entre autres des sels et des agents stabilisants. • MgCl2: Un cofacteur nécessaire pour l'activité de la Taq polymérase pendant la réaction de PCR.

20. 1-LES COMPOSANTS DE LA PCR EN TEMPS REEL • Plaques ou tubes PCR : Les contenants dans lesquels les réactions de PCR sont réalisées. Les réactions de PCR peuvent être réalisées dans des plaques à puits multiples ou des tubes PCR individuels.

21. 1-LES COMPOSANTS DE LA PCR EN TEMPS REEL • Eau déionisée : Utilisée comme solvant pour diluer les réactifs et les échantillons. • Sonde ou colorant fluorescent : Utilisé pour détecter l'ADN amplifié en temps réel pendant la réaction de PCR. Dans la PCR en temps réel, il existe différents types de sondes utilisées pour détecter et mesurer l'ADN amplifié. Voici quelques-uns des principaux types de sondes :

22. 1-LES COMPOSANTS DE LA PCR EN TEMPS REEL • Sondes TaqMan: Les sondes TaqMan sont des oligonucléotides marquées avec un fluorophore à une extrémité et un quencher à l'autre extrémité. - Pendant la PCR en temps réel, la sonde TaqMan se lie spécifiquement à la séquence d'ADN cible entre les amorces. Lorsque la Taq polymérase atteint la sonde pendant la réaction, elle dégrade la sonde, libérant ainsi le fluorophore. La libération du fluorophore permet la détection de la fluorescence émise, indiquant la présence et la quantité d'ADN amplifié

24. 1-LES COMPOSANTS DE LA PCR EN TEMPS REEL • Sondes MolecularBeacon: Les sondes MolecularBeacon sont des sondes fluorescentes en forme de boucle qui se replient sur elles-mêmes lorsqu'elles ne sont pas liées à une séquence d'ADN complémentaire. Pendant la PCR en temps réel, la sonde MolecularBeacon se lie spécifiquement à la séquence d'ADN cible. Lorsque la sonde se lie à la séquence cible, elle change de conformation et libère le fluorophore, ce qui permet la détection de la fluorescence émise.

26. 1-LES COMPOSANTS DE LA PCR EN TEMPS REEL Dans la PCR en temps réel, plusieurs colorants fluorescents peuvent etre aussi utilisés pour détecter et mesurer l'ADN amplifié. Voici quelques-uns des principaux colorants fluorescents utilisés : • SYBR Green : Le SYBR Green est l'un des colorants fluorescents les plus couramment utilisés en PCR en temps réel. Il interagit de manière non spécifique avec l'ADN double brin produit pendant la réaction de PCR.

27. 1-LES COMPOSANTS DE LA PCR EN TEMPS REEL Le SYBR Green se lie à l'ADN double brin et émet de la fluorescence lorsqu'il est excité par la lumière à la longueur d'onde appropriée. La quantité de fluorescence émise est proportionnelle à la quantité d'ADN double brin présent dans l'échantillon, ce qui permet une quantification relative de l'ADN amplifié.

29. 1-LES COMPOSANTS DE LA PCR EN TEMPS REEL • EvaGreen : L'EvaGreen est un autre colorant fluorescent couramment utilisé en PCR en temps réel. Il fonctionne de manière similaire au SYBR Green en interagissant avec l'ADN double brin produit pendant la réaction de PCR. L'EvaGreen se lie à l'ADN double brin et émet de la fluorescence, permettant une quantification relative de l'ADN amplifié.

30. Ces colorants fluorescents sont utilisés pour détecter et mesurer l'ADN amplifié en temps réel pendant la réaction de PCR.

31. 1-LES COMPOSANTS DE LA PCR EN TEMPS REEL En plus de ces composants chimiques, les équipements suivants sont également nécessaires : • Thermocycleur : Appareil permettant de faire varier la température pour chaque cycle de PCR. • Système de détection de fluorescence : Intégrer au thermocycleur pour mesurer l'émission de fluorescence en temps réel, ce qui permet de quantifier l'ADN amplifié à chaque cycle.

33. 2-LES ETAPES DE REALISATION DE LA PCR EN TEMPS RÉEL Voici les principales étapes de réalisation de la PCR en temps réel : • Préparation des réactifs : Les réactifs nécessaires à la PCR en temps réel sont préparés dans un laboratoire aseptique. Cela comprend la préparation des amorces spécifiques à la séquence cible, la dilution des nucléotides (dNTPs), la préparation de la Taq polymérase et la préparation des sondes ou des colorants fluorescents.

34. 2-LES ETAPES DE REALISATION DE LA PCR EN TEMPS RÉEL • Préparation du milieux réactionnel: Les réactifs(l'ADN à amplifier, les dNTPs, les deux amorces, la Taq polymérase, un tampon et des ions magnésium (MgCl2), les sondes…..) sont mélangés dans un tube ou une plaque de PCR dans les proportions appropriées pour former le mélange de réaction. Le mélange de réaction est généralement préparé sur glace pour minimiser toute dégradation d'ADN ou d'enzyme. Des contrôles positifs et négatifs peuvent également être inclus pour vérifier la spécificité et l'efficacité de la réaction.

37. 2-LES ETAPES DE REALISATIONS DE LA PCR EN TEMPS RÉEL • Programmation du thermocycleur(Cycle PCR) : Le thermocycleur est programmé avec un protocole spécifique qui définit les paramètres de température et de durée de chaque cycle de PCR. Ces paramètres incluent:

38. 2-LES ETAPES DE REALISATIONS DE LA PCR EN TEMPS RÉEL Dénaturation :La température dans le tube est réglée à 95°C. A ce moment là, l’ADN se dénature. En effet, l’ADN perd sa structure caractéristique en double hélice, les liaisons hydrogène reliant les bases de chaque brin d’ADN étant instables à cette température. L’ADN double-brin (2 brins) est dénaturé en ADN simple brin (1 brin).

40. 2-LES ETAPES DE REALISATION DE LA PCR EN TEMPS RÉEL Hybridation (Appariement) :Ensuite la température est descendue à la température dite d’hybridation. Cette dernière est généralement comprise entre 50°C et 60°C et elle est fonction de la composition en désoxyribonucléotides (dATP, dTTP, dGTP, et dCTP) des amorces. Les amorces reconnaissent et se fixent à leurs séquences complémentaires en reformant des liaisons hydrogène. On dit que les amorces s’hybrident au brin d’ADN.

42. 2-LES ETAPES DE REALISATIONS DE LA PCR EN TEMPS RÉEL Élongation ou extension: la température est réglée à 72°C, température idéale pour l’activité de la Taq polymérase. C’est une enzyme très spéciale, puisqu’elle est dite thermorésistante, parce que sa température optimale d'action est de 72°C et qu'elle est capable de résister à des températures allant jusqu’à 100°C.

44. 2-LES ETAPES DE REALISATIONS DE LA PCR EN TEMPS RÉEL • Exécution de la réaction de la PCR en temps réel : Une fois que les échantillons sont chargés dans le thermocycleur, la réaction de PCR est lancée. Le thermocycleur effectue les cycles de chauffage et de refroidissement nécessaires pour dénaturer l'ADN matrice, permettre l'hybridation des amorces, l'extension des brins d'ADN par la Taq polymérase et la détection de la fluorescence émise par les sondes ou les colorants fluorescents a chaque cycle.

45. 2-LES ETAPES DE REALISATIONS DE LA PCR EN TEMPS RÉEL • Répétition des cycles :Les étapes de dénaturation, d’hybridation et d’élongation sont répétées de 20 à 40 fois, en fonction du nombre de cycles programmés pour amplifier l’ADN à un niveau détectable.

47. 3-Analyse des données de la PCR en temps réel 3-1- Les méthodes de contrôles des données de la PCR en temps réel Les méthodes de contrôle des données de la PCR en temps réel sont essentielles pour garantir la précision et la fiabilité des résultats. Ainsi nous pouvons citer entre autre: • Les Contrôles positifs: Inclure un échantillon avec une concentration connue de l'ADN cible pour s'assurer que la PCR fonctionne correctement. Cela confirme que le système de détection est capable de détecter l'ADN cible.

48. 3-1- Les méthodes de contrôles des données de la PCR en temps réel • Les Contrôles négatifs : Utiliser un échantillon sans ADN cible (par exemple, de l'eau ou un tampon sans ADN) pour détecter toute contamination croisée. Si ce contrôle montre une amplification, cela indique une contamination des réactifs ou des échantillons. • Les contrôles internes: Une séquence d'ADN ou d'ARN est ajoutée à chaque échantillon avant la PCR, indépendamment de la cible d'intérêt. Le contrôle interne sert à vérifier la qualité de l'extraction d'ADN ou d'ARN, ainsi que l'absence d'inhibiteurs dans l'échantillon. Il permet de déterminer si la PCR a été correctement réalisée et si les conditions de réaction étaient optimales.

49. 3-2-Identification du cycle seuil Le cycle seuil (Ct) est le cycle de la PCR où le signal détecté atteint un niveau seuil défini. Pendant la réaction de PCR, le thermocycleur mesure la fluorescence émise à chaque cycle de réaction. Les courbes de fluorescence sont générées et offre 4 phases distinctes qui permettent l’identification du cycle seuil :

50. 3-2-Identification du cycle seuil Phase de bruit de fond : la quantité de fragments amplifiés est insuffisante pour générer un signal fluorescent supérieur au bruit de fond. Phase exponentielle : la quantité de fragments amplifiés génère un signal fluorescent supérieur au seuil de détection de l’appareil. À ce stade, le nombre de copies de l'ADN double à chaque cycle de réaction. C'est la phase la plus importante car elle permet une quantification précise de l'ADN initial présent dans l'échantillon grâce au cycle seuil.