Guillaume van der Rest Laboratoire des Mécanismes Réactionnels

1. Comment étendre nos connaissances des réactions ion-molécule sur des petits systèmes à des composés biologiques ? Guillaume van der Rest Laboratoire des Mécanismes Réactionnels Ecole Polytechnique, 91128 Palaiseau Cedex

2. Plan de l’exposé : • Introduction: les propriétés qui changent • Fonctionnalisation • Durée de vie des complexes • Méthodes d’ionisation • Réactions de transfert de proton • Systèmes peptidiques monochargés • Systèmes multichargés: peptides et protéines • Réactions d’échange hydrogène – deutérium • Etude structurale en phase gazeuse • Mécanismes mis en jeu • Autres réactions • Ion simple – molécule neutre biologique • Ion peptide ou oligonucléotide – molécule neutre • Perspectives et avenir

3. Des systèmes polyfonctionnels • Peptide et protéines: polyamides fonctionnalisés par des groupes –OH, -NH2, -CONH2, -COOH, -SH et groupements aromatiques. • Oligosaccharides: éthers, carbonyles, hydroxy et amines. • Oligonucléotides: phosphates en plus des précédents. • Des fonctions classiques, pas d’espèces « exotiques » • Une richesse chimique qui proviendra des nombreuses possibilités d’interactions entre les sites réactifs.

4. Durée de vie du complexe de réaction • Petit système : peu de degrés de liberté dans le complexe. • Si la pression est très faible: k1+ k-1>> kc [B] + kr • La réaction conduira majoritairement à une dissociation (réactive ou non) du complexe de réaction. • Système biologique : un grand nombre de degrés de liberté. • k1+ k-1<< kc [B] + kr • La stabilisation de l’adduit par réactions termoléculaires ou émission radiative est dominante.

5. Changement de méthodes d’ionisation • Méthode classique: ionisation par impact électronique • Inadaptée à des composés majoritairement peu volatiles et sensibles à la température. • Méthode dure menant à de multiples fragmentations des composés. • Méthodes modernes: électronébullisation (ESI) et désorption-ionisation laser assistée matrice (MALDI) • De la solution à l’ionisation de façon directe. • Méthodes douces. • Ionisation possible en ions positifs ou négatifs. • Leur développement a ouvert la spectrométrie de masse comme technique de choix pour l’analyse de composés biologiques.

6. Deux mots sur l’électronébullisation • Production d’ions multichargés lorsque le nombre de sites basiques devient suffisant.

7. Réactions de transfert de proton • Mesure des affinités protoniques (PA) et des basicités en phase gazeuse (GB) B(g) + H+(g)→ BH+(g) AP(B) = -ΔH0 ; BG(B) = -ΔG0 • Méthodes de mesure: • équilibre : BH+ + Bref B + BrefH+ΔG0 = -RT ln(K) • cinétique : • Pour des composés peu volatiles, il est difficile d’obtenir une mesure par équilibre. ΔG0 = -RTeff ln(k1/k2)

8. Cas des polyglycines A.G. Harrison, Mass Spectrom. Rev., 16, 201-217 (1997) et références citées

9. Peptides contenant de la lysine • Acide aminé bidendate • GB: 221.8 kcal/mol • Un des trois plus basiques avec Arg et His • La basicité dépend de la position des sites basiques. S.R. Carr, C.J. Cassady, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 7, 1203 (1996) Z. Wu, C. Fenselau, Tetrahedron, 49, 9197 (1993)

10. Peptides monochargés • Basicité fonction des groupes basiques présents • Accroissement de la basicité avec la taille • Meilleure solvatation intramoléculaire de la charge, qui atteint environ 15 kcal/mol pour les chaînes les plus longues. • Un effet de la structure secondaire existe, mais n’est pas prédominant. • Difficultés de mesure, liées à la possibilité d’existence de plusieurs conformères. • Un traitement des variations d’entropie reste à faire pour obtenir des valeurs d’affinités protoniques.

11. Ions multichargés • Apparition d’une barrière coulombienne supplémentaire à la dissociation du complexe de réaction. • Impossibilité de mesurer PA (ou GB) par des méthodes cinétiques. • Définition d’une PAapp (ou GBapp) incluant la barrière électrostatique. P.D. Schnier, D.S. Gross, E.R. Williams, J. Am. Chem. Soc., 117, 6747 (1995).

12. Effet des charges multiples sur la basicité: cas du cytochrome c • 104 acides aminés, 24 sites basiques (Lys, His ou Arg). GDVEKGKKIF VQKCAQCHTV EKGGKHKTGP NLHGLFGRKT GQAPGFTYTD ANKNKGITWK EETLMEYLEN PKKYIPGTKM IFAGIKKKTE REDLIAYLKK ATNE GB intrinsèques GBapp mesurées GB méthanol P.D. Schnier, D.S. Gross, E.R. Williams, J. Am. Chem. Soc., 117, 6747 (1995).

13. Bradykinine et ses homologues doublement chargés Bradykinine: Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg Des-Arg1-Bk: Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg Des-Arg9-Bk: Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe • Evolution des basicités attendue en fonction des sites disponibles et des répulsions électrostatiques. • Ecart important sur les valeurs obtenues par deux méthodes différentes. N.P. Ewing, G.A. Pallante, X. Zhang, C.J. Cassady, J. Mass Spectrom., 36, 875 (2001)

14. Des formes zwitterioniques? • De telles structures ont été mises en évidence pour la forme monochargée de la bradykinine. Elles sont possibles pour [M+2H]2+. 2 H+ sur les Arg, 1 H+ sur N-terminal et COO- sur le C-terminal 2 H+ sur les Arg • Suivant les conditions de formation des ions, il pourrait y avoir deux formes ioniques et donc deux valeurs de basicité différentes. A.C. Gill, K.R. Jennings, T. Wyttenbach, M.T. Bowers, Int. J. Mass Spectrom., 195/196, 685 (2000)

15. Echanges hydrogène – deutérium • Un champ d’application de la spectrométrie de masse qui connaît un développement considérable. • Une voie d’accès par spectrométrie de masse à la structure tertiaire des protéines.

16. Peptides avec des ponts disulfures Vasopressine [M+2H]2+ TGF-α [M+3H]3+ (a) Avec ponts disulfures intacts (b) Avec ponts disulfures réduits J. Wang, C.J. Cassady, Int. J. Mass Spectrom., 182/183, 233 (1999)

17. Echanges H/D sur le cytochrome c Temps de réaction avec D2O • Déplacement progressif vers des masses plus élevées • Dédoublement de certains massifs isotopiques D. Suckau, Y. Shi, S.C. Beu, M.W. Senko, J.P. Quinn, F.M. Wampler III, F.W. McLafferty, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 90, 790 (1993)

18. Mise en évidence de conformations coexistantes Conformation dépliée Formation d’une hélice α Conformation native • Le nombre d’hydrogènes échangés permet de délimiter des conformations. • La conformation adoptée en fonction de l’état de charge est parallèle à l’évolution en fonction du pH en solution. D. Suckau, Y. Shi, S.C. Beu, M.W. Senko, J.P. Quinn, F.M. Wampler III, F.W. McLafferty, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 90, 790 (1993)

19. Mécanisme de l’échange H/D • Cinq mécanismes possibles identifiés par le groupe de Beauchamp sur des oligomères de glycine. Mécanisme ion onium PA du neutre suffisamment élevée Mécanisme relai PA du neutre faible, assistance par une fonction voisine S. Campbell, M.T. Rodgers, E.M. Marzluff, J.L. Beauchamp, J. Am. Chem. Soc., 117, 12840 (1995)

20. Mécanisme « salt bridge » Mécanisme flip-flop Mécanisme par tautomérie

21. Limitations analytiques des échanges H/D • Limité aux conformations en phase gazeuse alors que les biologistes s’intéressent aux conformations en solution. • Déplacement des deutériums lors d’une activation collisionnelle ou infra-rouge. • Tentatives de modélisation des cinétiques d’échange pour étudier l’accessibilité des sites (F. He et A.G. Marshall): problème du grand nombre de sites possibles. F. He, A.G. Marshall, J. Phys. Chem. A (?)

22. Autres réactions ion – molécule • Pour les raisons de durée de vie du complexe, il est nécessaire que les réactions envisagées soient rapides. • Une des conditions suivantes est requise : • Des réactifs avec faible énergie d’activation donc très actifs chimiquement • Des molécules biologiques petites, menant à des complexes à durée de vie limitée. • Former un adduit à longue durée de vie, mais qui aura conduit à une modification chimique lors de sa formation. • R.A.J. O’Hair et quelques autres groupes ont travaillé sur des réactions de type additions nucléophiles ou électrophiles. R.A.J. O’Hair, J. Mass Spectrom., 35, 1377 (2000)

23. Réactifs électrophiles • Electrophiles forts: éviter que la réaction dominante soit un transfert de proton. PCl2+, CH2=O-CH3+, RCO+ (R=CH3, C6H5, C6F5, (CH3)2N) • Exemple de RCO+: exothermicité de la réaction comprise entre 37.5 et 47.9 kcal/mole • Nécessité de faire passer le peptide en phase gazeuse. • Utilisation de nouvelles techniques: Désorption acoustique induite par laser couplée à un FT-ICR (LIAD-FTMS) Y.-Q. Yu, C.L. Stumpf, H.L. Kenttämaa, Int. J. Mass Spectrom., 195/196, 609 (2000) M.A. Freitas, R.A.J. O’Hair, S. Dua, J.H. Bowie, Chem. Commun., 1409 (1997) G.E. Reid, S.E. Tichy, J. Pérez, R.A.J. O’Hair, R.J. Simpson, H.L. Kenttämaa, J. Am. Chem. Soc., 123, 1184 (2001)

24. Réaction avec les ions acylium

25. Réactif: gaz neutre • Sur les peptides protonés: • Nucléophile conduisant à une réaction d’addition-élimination par des amines • Protonation du réactif par le peptide, formant « in situ » un réactif électrophile par lequel on se ramène au cas précédent. R.A.J. O’Hair, G.E. Reid, J. Am. Soc. Mass Spectrom., 11, 244 (2000) E.H. Gur, L.J. de Koning, N.M.M. Nibbering, Int. J. Mass Spectrom., 167/168, 135 (1997)

26. Substitution nucléophile sur des oligonucléotides • Sur des oligonucléotides [M-nH]n-n > 1 • Le produit de la réaction mène à de nouvelles fragmentations plus complètes sous activation collisionnelle. R.A.J. O’Hair, S.A. McLuckey, Int. J. Mass Spectrom., 162, 183 (1997)

27. Conclusions et perspectives • Par le travail réalisé en amont sur les petits systèmes, les bases sont bien posées et sont applicables à des systèmes biologiques. • aspects énergétiques, cinétiques, collisionnels • mécanismes de réaction qui restent du domaine de la chimie • Des questions se posent sur la nature chimique précise du composé biologique. • Sites de protonation, formation de zwittérions, plusieurs conformations possibles. • Lié au mécanisme de formation de l’ion • Problème également rencontré pour de petits systèmes auxquels notre groupe s’intéresse depuis quelques années et qui peut s’étudier par des réactions ion-molécule.

28. Conclusions et perspectives (II) • Arrivée prochaine d’un instrument de FT-ICR avec des sources adaptées à l’étude de systèmes biologiques. • Projets d’étude de réaction ion-molécule dans les directions données dans l’exposé. • Etude d’agrégats plus complexes qui peuvent se former dans la source ESI et de leur propriétés chimiques. • Deux objectifs: meilleure compréhension des interactions «faibles» en phase gazeuse et leur effet sur la réactivité chimique ainsi que d’apporter nos compétences de chimistes en phase gazeuse à la résolution de problèmes analytiques pour des biologistes.