MIN – Untersuchungen beim sporadischen Nierenzellkarzinom Zwischenergebnisse

1. MIN – Untersuchungen beim sporadischen NierenzellkarzinomZwischenergebnisse • Was ist Mikrosatelliteninstabilität (MIN) ? • Was ist Alu/AP - PCR ? • Methoden/ Materialien • Ergebnisse • Ausblicke

2. Was ist Mikrosatelliteninstabilität ( MIN ) ? Mikrosatelliten: kurze polymorphe Tandemrepeats,1% des Genoms Mono-,Di-,Tri-,Tetra - Nukleotidsequenzen 10-50 Kopien von 1-6 Basenpaarmotiven(Cunningham et al. IOS Press, 1999) treten ungefähr aller 100000 Basenpaaren einmal auf fungieren vermutlich als Promotoren, Bindungsstellen für Topoisomerasen Relativ konstant übers Genom verteilt, zu 90 % heterozygot, Brauch et al. Vorwiegend in intronischen DNA - Abschnitten gelegen Längenveränderungen dieser DNA – Abschnitte (MIN/ Replication Error Phänotyp) verweisen auf genetische Instabilität  Expansionen/ Kontraktionen während Replikation

3. Replikation Expansion Fehlpaarungen (Mismatches) Kontraktion

4. Historie von MIN • MIN wird ursprünglich 1993 beim HNPCC - Syndrom (hereditäres nicht polypöses Kolonkarzinom) beschrieben(Aaltonen et al. Science 260; Ionov et al.Nature 363, Thibodeau et al. Science 260) • HNPCC assoziierte Tumore weisen zu 80 - 90% MIN auf • Physiologisches Auftreten von Fehlpaarungen (Mismatches) im Bereich einfach - repetitiver Sequenzen während der DNA - Replikation bei Bakterien/ Hefen Mismatch-Reparaturenzyme korrigieren Replikationsfehler • 6 DNA - (mismatch) Reparaturgene  3 homolog zum bakteriellen MutS: hMSH2, hMSH3, hMSH6 3 homolog zum bakteriellen MutL: hMLH1, hPMS1, hPMS2

5. Historie von MIN • 1993 Klonierung des ersten Mismatch-Repairgen hMSH2 (Fishel et al) aus Kolonkarzinom - DNA  Keimbahnmutation ist wesentlicher Faktor für HNPCC - Syndrom • Voraussetzung für MIN - positive Karzinome ist Inaktivierung beider Allele eines Mismatch-Repairgens (“two – hit” Modell nach Knudson, PNAS 68) • Diagnostik bei HNPCC mittels MIN - Analyse mit immunhistochemischer Repairgen - Expressionsbestimmung (anti - hMSH2, anti - hMLH1 am Tumor) : positiv  Sequenzierung von hMSH2, hMLH1 in Normal - DNA • 5 Mikrosatelliten: BAT 25, BAT 26, D5S346, D17S250, D2S123

6. MIN in Nicht - HNPCC assoziierten sporadischen Tumoren Modifiziert nach Cunnigham et al. IOS Press 1999

7. Methoden und Materialien AP - PCR: • Unterschied zu gewöhnlicher PCR: Generierung einer reproduzierbaren Schar von Produkten (genomischer DNA- Fingerabdruck) mit einem Primer • Voraussetzung: Alu- Verdau, ~ 450 bp große Fragmente • Alu - Sequenz: 5% des Genoms, assoziiert mit 50 - 80% bestimmter Mikrosatelitten am 3 ‘ Ende auf • somatische Mutationen von Di- und Trinukleotiden treten mit veränderten Alu - Sequenzen auf  Sood und Buller (Oncogene 13): 36 von 68 Ovarialtumoren mit MIN weisen veränderte Alu/ AP - PCR Bandenmuster Blut - DNA

8. Methoden und Materialien • Ablauf:  DNA - Isolation aus Gefriermaterial mittels Salzextraktion (Tumor-, Normalgewebe)  Konzentrationsmessung  a) 20 ng - Verdünnung für Mikrosatelitten - PCR b) DNA - Verdau mit ALU 1 für AP - PCR c) Kontrolle der PCR - Produkte im Agarose - Gel  Denaturierung mittels Hitze und Formamid - Puffer  Auftragen der PCR - Produkte auf PAA - Gel mit anschließender Silberfärbung  Vergleich des Bandenmusters von Normal- und Tumorgewebe • Probleme: nach absoluten Schwierigkeiten mit AP - PCR muß diese für die ersten 100 Patienten abgearbeitet werden

9. Christian Höfling: Methoden und Materialien Einsatz von 6 Mikrosatellitenmarkern: Dietmaier et al. Cancer Res 57, 1997

10. Ergebnisse • 40 Patienten mit 5 Markern untersucht •  BAT 25, Bat 26, REN, MYCL1, tp53Alu (RB wird optimiert)  Patient 13 und 40 bei tp53Alu/ MYCL1 auffällig • ab Patient 41 nur noch: REN, MYCL1, tp53Alu • 100 Patienten mit MYCL1 und tp53Alu untersucht  nur noch Patient 41 bei tp53Alu/ MYCL1 auffällig (REN steht bei Patient 72) AP – PCR: PCR klappt nach größeren Problemen  Auftragen der Proben auf PAA – Gel zeigt erwartetes Ergebnis

11. Ergebnisse • MIN bei Pat. 13, 40, 41 • auffällige Marker: tp53Alu • MYCL 1 MYCL1 Expansion    LOH T 13 N 13 T 14 N 14 Vergleich +/ - MIN bei Pat.13/ 14

12. Ergebnisse tp53ALU MYCL1 AP - PCR LOH  T 41 N 41  shift T 13 N 13 T 41 N 41

13. Ergebnisse Verdünnungsreihe der PCR - Produkte für tp53Alu (µl PCR - Produkt zur Fällung) 10 5 2 1 0,5 10 5 2 1 0,5 10 5 2 1 0,5 10 5 2 1 0,5 10 5 2 1 0,5   sensitiver Nachweis von gemischten DNA - Mengen möglich (schwache PCR - Produkte sind nicht kritisch für MIN - Nachweis) 125 ng 750 ng 500 ng 250 ng 63 ng T 40 N 40 von 50 µl Gesamtansatz Standards        100 bp Leiter   10 µl auf PAA - Gel 10 µl auf Agarosegel

14. Ergebnisse • Einsatz eines alten PCR - Produktes als Template in neue AP - PCR  altes PCR - Produkt wurde verdünnt: 1:10 1: 50 1: 00 • jeweils 2 µl von Verdünnung eingesetzt • Resultat:  reproduzierbares Bandenmuster unabhängig von Templatemenge  stabile Nachweismethode genetischer Instabilität 1:100 1:50 1:10   

15. Ausblicke • Verwendung neuer Marker im Bereich von Tumorsuppressorgenen des Chromosoms 3: • 2 Marker der VHL - Region •  D3S1560, D3S1317 • 2 Marker der FHiT - Region •  D3S1300, D3S4260    

16. Ausblicke • Auskunft über postoperative klinische Daten  Rückantwortbrief an niedergelassenen Urologen/ Hausarzt (Korrelation zw. Patientenkarriere und MIN ?) • Immunhistochemie der Mismatch - Reparaturenzyme  Zusammenarbeit mit Thomas • mRNA - Expressionsprofile: Wahrscheinlichkeit einer umfassenden genomischen Instabilität von bekannten Markern • anvisiertes Ende der Experimente: Ende 2002