PCR
This presentation is the property of its rightful owner.
Sponsored Links
1 / 40

PCR Scelta dello stampo Scelta dei primer PowerPoint PPT Presentation


  • 69 Views
  • Uploaded on
  • Presentation posted in: General

PCR Scelta dello stampo Scelta dei primer. PCR da DNA genomico. PCR da mRNA (RT-PCR). Uso dei “linkers”. Vettori dA:dT. 3’. 5’. 3’. 5’. 5’. 3’. 3’. 5’. PCR da DNA genomico. EcoRI. BamHI. EcoRI. BamHI. Proteine di fusione. prom. Tag o rep. term. cDNA. trascrizione

Download Presentation

PCR Scelta dello stampo Scelta dei primer

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Presentation Transcript


Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

  • PCR

  • Scelta dello stampo

  • Scelta dei primer


Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

PCR da DNA

genomico


Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

PCR da mRNA (RT-PCR)


Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

Uso dei “linkers”


Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

Vettori dA:dT

3’

5’

3’

5’

5’

3’

3’

5’


Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

PCR da DNA

genomico

EcoRI

BamHI

EcoRI

BamHI


Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

Proteine di fusione

prom

Tag o rep.

term

cDNA

trascrizione

traduzione


Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

Elettroforesi di acidi nucleici

  • Gel di agarosio

  • Gel di acrilammide


Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

Elettroforesi su gel di agarosio


Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

Tamponi di elettroforesi


Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

Soluzioni di caricamento


Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

Soluzioni di caricamento

  • Aumentano la densità del campione

  • Colorano il campione

  • Rendono visibile la corsa elettroforetica


Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

Migrazione del DNA su gel


Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

Fattori che influenzano la migrazione

  • Peso molecolare

  • Concentrazione di agarosio

  • Conformazione DNA

  • Voltaggio applicato

  • Intercalanti

  • Tampone di elettroforesi


Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

Visualizzazione del DNA


Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

Marcatori di peso molecolare

 HindIII


Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

Fotodocumentazione


Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

Recupero DNA da gel

  • Elettroeluizione

  • Agarosio “low melting”

  • Solubilizzazione agarosio


Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

Gel di acrilammide


Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

Apparato per gel di acrilammide


Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

Metodi di sequenziamento

  • Sanger (enzimatico)

  • Maxam e Gilbert (chimico)


Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

Metodo di Sanger

primer

quattro dNTP (incluso 32PdNTP)

DNA polimerasi

ddTTP

ddCTP

ddGTP

ddATP

primer

nuovo DNA

dideossinucleotide

terminatore

La catena neosintetizzata termina quando un ddNTP è incorporato al posto di un dNTP

Denaturare e separare su gel di poliacrilammide


Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

Metodo di Maxam e Gilbert

DNA singolo filamento marcato ad una estremità

32P

4 o 5 reazioni di modificazione base-specifiche

Es. metilazione delle G con dimetilsolfato

Rottura del filamento in corrispondenza della base modificata mediante piperidina

Separare i frammenti marcati su gel di acrilammide


Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

Gel di poliacrilammide di sequenza


Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

Fasi di un progetto di sequenziamento

  • clonaggio e preparazione del DNA

  • reazioni di sequenza

  • elettroforesi su gel di poliacrilammide

  • interpretazione e raccolta dati


Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

Vettori a singolo filamento


Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

Fagemidi


Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

Strategie di sequenziamento

  • Primer specifici consecutivi

  • Delezioni progressive

  • Frammenti casuali (shotgun)


Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

Reazioni base-specifiche


Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

Confronto metodi di sequenziamento


Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

Sequenziamento automatico


Pcr scelta dello stampo scelta dei primer

Sequenziamento con Taq polimerasi


  • Login