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PCR Scelta dello stampo Scelta dei primer PowerPoint PPT Presentation


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PCR Scelta dello stampo Scelta dei primer. PCR da DNA genomico. PCR da mRNA (RT-PCR). Uso dei “linkers”. Vettori dA:dT. 3’. 5’. 3’. 5’. 5’. 3’. 3’. 5’. PCR da DNA genomico. EcoRI. BamHI. EcoRI. BamHI. Proteine di fusione. prom. Tag o rep. term. cDNA. trascrizione

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PCR Scelta dello stampo Scelta dei primer

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Presentation Transcript


  • PCR

  • Scelta dello stampo

  • Scelta dei primer


PCR da DNA

genomico


PCR da mRNA (RT-PCR)


Uso dei “linkers”


Vettori dA:dT

3’

5’

3’

5’

5’

3’

3’

5’


PCR da DNA

genomico

EcoRI

BamHI

EcoRI

BamHI


Proteine di fusione

prom

Tag o rep.

term

cDNA

trascrizione

traduzione


Elettroforesi di acidi nucleici

  • Gel di agarosio

  • Gel di acrilammide


Elettroforesi su gel di agarosio


Tamponi di elettroforesi


Soluzioni di caricamento


Soluzioni di caricamento

  • Aumentano la densità del campione

  • Colorano il campione

  • Rendono visibile la corsa elettroforetica


Migrazione del DNA su gel


Fattori che influenzano la migrazione

  • Peso molecolare

  • Concentrazione di agarosio

  • Conformazione DNA

  • Voltaggio applicato

  • Intercalanti

  • Tampone di elettroforesi


Visualizzazione del DNA


Marcatori di peso molecolare

 HindIII


Fotodocumentazione


Recupero DNA da gel

  • Elettroeluizione

  • Agarosio “low melting”

  • Solubilizzazione agarosio


Gel di acrilammide


Apparato per gel di acrilammide


Metodi di sequenziamento

  • Sanger (enzimatico)

  • Maxam e Gilbert (chimico)


Metodo di Sanger

primer

quattro dNTP (incluso 32PdNTP)

DNA polimerasi

ddTTP

ddCTP

ddGTP

ddATP

primer

nuovo DNA

dideossinucleotide

terminatore

La catena neosintetizzata termina quando un ddNTP è incorporato al posto di un dNTP

Denaturare e separare su gel di poliacrilammide


Metodo di Maxam e Gilbert

DNA singolo filamento marcato ad una estremità

32P

4 o 5 reazioni di modificazione base-specifiche

Es. metilazione delle G con dimetilsolfato

Rottura del filamento in corrispondenza della base modificata mediante piperidina

Separare i frammenti marcati su gel di acrilammide


Gel di poliacrilammide di sequenza


Fasi di un progetto di sequenziamento

  • clonaggio e preparazione del DNA

  • reazioni di sequenza

  • elettroforesi su gel di poliacrilammide

  • interpretazione e raccolta dati


Vettori a singolo filamento


Fagemidi


Strategie di sequenziamento

  • Primer specifici consecutivi

  • Delezioni progressive

  • Frammenti casuali (shotgun)


Reazioni base-specifiche


Confronto metodi di sequenziamento


Sequenziamento automatico


Sequenziamento con Taq polimerasi


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