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PCR Scelta dello stampo Scelta dei primer

PCR Scelta dello stampo Scelta dei primer. PCR da DNA genomico. PCR da mRNA (RT-PCR). Uso dei “linkers”. Vettori dA:dT. 3’. 5’. 3’. 5’. 5’. 3’. 3’. 5’. PCR da DNA genomico. EcoRI. BamHI. EcoRI. BamHI. Proteine di fusione. prom. Tag o rep. term. cDNA. trascrizione

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PCR Scelta dello stampo Scelta dei primer

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Presentation Transcript

  1. PCR • Scelta dello stampo • Scelta dei primer

  2. PCR da DNA genomico

  3. PCR da mRNA (RT-PCR)

  4. Uso dei “linkers”

  5. Vettori dA:dT 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’

  6. PCR da DNA genomico EcoRI BamHI EcoRI BamHI

  7. Proteine di fusione prom Tag o rep. term cDNA trascrizione traduzione

  8. Elettroforesi di acidi nucleici • Gel di agarosio • Gel di acrilammide

  9. Elettroforesi su gel di agarosio

  10. Tamponi di elettroforesi

  11. Soluzioni di caricamento

  12. Soluzioni di caricamento • Aumentano la densità del campione • Colorano il campione • Rendono visibile la corsa elettroforetica

  13. Migrazione del DNA su gel

  14. Fattori che influenzano la migrazione • Peso molecolare • Concentrazione di agarosio • Conformazione DNA • Voltaggio applicato • Intercalanti • Tampone di elettroforesi

  15. Visualizzazione del DNA

  16. Marcatori di peso molecolare  HindIII

  17. Fotodocumentazione

  18. Recupero DNA da gel • Elettroeluizione • Agarosio “low melting” • Solubilizzazione agarosio

  19. Gel di acrilammide

  20. Apparato per gel di acrilammide

  21. Metodi di sequenziamento • Sanger (enzimatico) • Maxam e Gilbert (chimico)

  22. Metodo di Sanger primer quattro dNTP (incluso 32PdNTP) DNA polimerasi ddTTP ddCTP ddGTP ddATP primer nuovo DNA dideossinucleotide terminatore La catena neosintetizzata termina quando un ddNTP è incorporato al posto di un dNTP Denaturare e separare su gel di poliacrilammide

  23. Metodo di Maxam e Gilbert DNA singolo filamento marcato ad una estremità 32P 4 o 5 reazioni di modificazione base-specifiche Es. metilazione delle G con dimetilsolfato Rottura del filamento in corrispondenza della base modificata mediante piperidina Separare i frammenti marcati su gel di acrilammide

  24. Gel di poliacrilammide di sequenza

  25. Fasi di un progetto di sequenziamento • clonaggio e preparazione del DNA • reazioni di sequenza • elettroforesi su gel di poliacrilammide • interpretazione e raccolta dati

  26. Vettori a singolo filamento

  27. Fagemidi

  28. Strategie di sequenziamento • Primer specifici consecutivi • Delezioni progressive • Frammenti casuali (shotgun)

  29. Reazioni base-specifiche

  30. Confronto metodi di sequenziamento

  31. Sequenziamento automatico

  32. Sequenziamento con Taq polimerasi

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