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PCR Scelta dello stampo Scelta dei primer - PowerPoint PPT Presentation


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PCR Scelta dello stampo Scelta dei primer. PCR da DNA genomico. PCR da mRNA (RT-PCR). Uso dei “linkers”. Vettori dA:dT. 3’. 5’. 3’. 5’. 5’. 3’. 3’. 5’. PCR da DNA genomico. EcoRI. BamHI. EcoRI. BamHI. Proteine di fusione. prom. Tag o rep. term. cDNA. trascrizione

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Presentation Transcript

  • PCR

  • Scelta dello stampo

  • Scelta dei primer


PCR da DNA

genomico




Vettori dA:dT

3’

5’

3’

5’

5’

3’

3’

5’


PCR da DNA

genomico

EcoRI

BamHI

EcoRI

BamHI


Proteine di fusione

prom

Tag o rep.

term

cDNA

trascrizione

traduzione


Elettroforesi di acidi nucleici

  • Gel di agarosio

  • Gel di acrilammide





Soluzioni di caricamento

  • Aumentano la densità del campione

  • Colorano il campione

  • Rendono visibile la corsa elettroforetica



Fattori che influenzano la migrazione

  • Peso molecolare

  • Concentrazione di agarosio

  • Conformazione DNA

  • Voltaggio applicato

  • Intercalanti

  • Tampone di elettroforesi





Recupero DNA da gel

  • Elettroeluizione

  • Agarosio “low melting”

  • Solubilizzazione agarosio




Metodi di sequenziamento

  • Sanger (enzimatico)

  • Maxam e Gilbert (chimico)


Metodo di Sanger

primer

quattro dNTP (incluso 32PdNTP)

DNA polimerasi

ddTTP

ddCTP

ddGTP

ddATP

primer

nuovo DNA

dideossinucleotide

terminatore

La catena neosintetizzata termina quando un ddNTP è incorporato al posto di un dNTP

Denaturare e separare su gel di poliacrilammide


Metodo di Maxam e Gilbert

DNA singolo filamento marcato ad una estremità

32P

4 o 5 reazioni di modificazione base-specifiche

Es. metilazione delle G con dimetilsolfato

Rottura del filamento in corrispondenza della base modificata mediante piperidina

Separare i frammenti marcati su gel di acrilammide



Fasi di un progetto di sequenziamento

  • clonaggio e preparazione del DNA

  • reazioni di sequenza

  • elettroforesi su gel di poliacrilammide

  • interpretazione e raccolta dati




Strategie di sequenziamento

  • Primer specifici consecutivi

  • Delezioni progressive

  • Frammenti casuali (shotgun)






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