ĆELIJSKE KULTURE
This presentation is the property of its rightful owner.
Sponsored Links
1 / 30

ĆELIJSKE KULTURE PowerPoint PPT Presentation


  • 120 Views
  • Uploaded on
  • Presentation posted in: General

ĆELIJSKE KULTURE. ŠTA JE ĆELIJSKA KULTURA ?. KULTURA ORGANA, KULTURA TKIVA – održavanje celih organa ili fragmenata tkiva u in vitro uslovima, uz očuvanje međućelijskih veza kakve postoje in vivo.

Download Presentation

ĆELIJSKE KULTURE

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Presentation Transcript


Elijske kulture

ĆELIJSKE KULTURE


Elijske kulture

ŠTA JE ĆELIJSKA KULTURA ?

KULTURA ORGANA, KULTURA TKIVA – održavanje celih organa ili fragmenata tkiva u in vitro uslovima, uz očuvanje međućelijskih veza kakve postoje in vivo.

KULTURA ĆELIJA – održavanje određenog tipa ćelija izolovanih iz odgovarajućeg organa/tkiva u in vitro uslovima.


Elijske kulture

ZAŠTO GAJITI ĆELIJE U KULTURI ?

  • Ispitivanje normalne ćelijske fiziologije i biohemije Npr. ispitivanje metaboličkih puteva praćenjem produkata razgradnje radioaktivno obeležene supstance

  • Testiranje efekata različitih jedinjenja na određeni tip ćelija

  • Npr. metaboliti, faktori rasta, hormoni, potencijalno toksične ili mutagene supstance, lekovi ...

  • Produkcija veštačkog tkiva kombinovanjem specifičnih tipova ćelija

  • Npr. potencijalno značajan način za formiranje “veštačke kože” u tretmanu opekotina


Elijske kulture

ZAŠTO GAJITI ĆELIJE U KULTURI ?

  • Sinteza korisnih, komercijalno značajnih bioloških produkata

  • Npr. Proteini koji su in vivo u ćeliji prisutni u minimalnim količinama, mogu se gajenjem ćelija in vitro proizvesti u količinama koje se mere gramima, pa i kilogramima (primena u biotehnologiji)


Elijske kulture

ŠTA SVE TREBA DA POSEDUJE LABORATORIJA ZA ĆELIJSKU KULTURU ?

  • STERILNI USLOVI

  • LAMINAR (hood, biosafety flow cabinet)


Elijske kulture

ŠTA SVE TREBA DA POSEDUJE LABORATORIJA ZA ĆELIJSKU KULTURU ?

  • INKUBATOR - održavanje esencijalnih parametara na nivoima optimalnim za očuvanje ćelijske kulture i vijabilnost ćelija

  • temperatura - obično 37C za sisarske ćelije

  • vlažnost vazduha – sprečava isparavanje medijuma

  • CO2 – najčešće 5%, održavanje pH medijuma


Elijske kulture

ŠTA SVE TREBA DA POSEDUJE LABORATORIJA ZA ĆELIJSKU KULTURU ?

  • POSUDE ZA GAJENJE ĆELIJA U KULTURI

Flaskovi – najčešće polistirenski, sa površinom adaptiranom za prijanjanje i rast ćelija

Petri ploče


Elijske kulture

ŠTA SVE TREBA DA POSEDUJE LABORATORIJA ZA ĆELIJSKU KULTURU ?

Mikrotirar ploče (multi-well plates) – 96-, 48-, 12-, 6 – well ploče


Elijske kulture

ŠTA SVE TREBA DA POSEDUJE LABORATORIJA ZA ĆELIJSKU KULTURU ?

Spinner bottles/flasks – staklene boce, sa centralnom teflonskom drškom sa magnetom; gajenje ćelija u suspenziji

Roller bottles – plastične boce; ćelije prijanjaju za celu unutrašnju površinu


Elijske kulture

ŠTA SVE TREBA DA POSEDUJE LABORATORIJA ZA ĆELIJSKU KULTURU ?

Cell factory


Elijske kulture

ŠTA SVE TREBA DA POSEDUJE LABORATORIJA ZA ĆELIJSKU KULTURU ?

  • MIKROSKOPI

Standardni

Inverzni


Elijske kulture

ŠTA SVE TREBA DA POSEDUJE LABORATORIJA ZA ĆELIJSKU KULTURU ?

  • CENTRIFUGE

  • KONTEJNERI SA TEČNIM AZOTOM


Elijske kulture

KAKO SE DOBIJAJU ĆELIJE ZA GAJENJE U KULTURI ?

  • PRIMARNA ĆELIJSKA KULTURA

ćelije se izoluju direktno iz životinje, i gaje u medijumu

mehanička izolacija – izvodi se presovanjem tkiva kroz filtere, procedura brza, ali visok stepen mehaničkog oštećenja ćelija

 enzimatska disagregacijatkiva do pojedinačnih ćelija – koriste se proteolitički enzimi, npr. tripsin ili kolagenaza


Elijske kulture

KAKO SE DOBIJAJU ĆELIJE ZA GAJENJE U KULTURI ?

U zavisnosti od organa iz kog se ćelije izoluju, primenjuju se različite eksperimentalne procedure:

- perfuzija organa rastvorom enzima

- inkubacija delova organa/tkiva u rastvoru enzima

VAŽNO!

Obezbediti što kraći kontakt tkiva i proteolitičkog enzima!

Tripsin – 10-20 min; duže izlaganje može da izazove oštećenje membrane

Kolagenaza – manje destruktivna na nivou ćelijske membrane, ali takođe zahteva brzo uklanjanje iz sistema


Elijske kulture

KAKO SE DOBIJAJU ĆELIJE ZA GAJENJE U KULTURI ?

Po završetku inkubacionog vremena/perfuzije, reakcija se prekida dodavanjem hladnog medijuma !

disagregacija tkiva i resuspendovanje ćelija praćeno uklanjanjem proteolitičkog enzima iz sistema brojnim ispiranjima i centrifugiranjem ćelija

KRAJNJI CILJ:

1.dobijanje “što čistijeg” preparata, tj. sa što manjim brojem drugih ćelija koje su sastavni deo tkiva iz kog se vrši izolacija

- tokom izolacije – centrifugiranjem na gradijentu,

- selektivnim gajenjem – postiže se odgovarajućim sastavom medijuma

2. zadovoljavajuća vijabilnost ćelija


Elijske kulture

KAKO SE DOBIJAJU ĆELIJE ZA GAJENJE U KULTURI ?

Nakon izolacije, određuje se broj ćelija u dobijenoj suspenziji, i pravi se suspenzija iz koje se ćelije sade u odgovarajuće ploče.

Potreban period za oporavak ćelija od izolacije i prijanjanje za podlogu, (2-24h) ! Tek nakon toga radi se tretman ćelija i sl...

Primarne ćelijske kulture imaju ograničen životni vek

(meri se danima/nedeljama)


Elijske kulture

KAKO SE DOBIJAJU ĆELIJE ZA GAJENJE U KULTURI ?

  • KONTINUALNA ĆELIJSKA KULTURA

Ćelije sa neograničenim kapacitetom proliferacije,

tzv. “besmrtne ćelije” !

KAKO NASTAJU KONTINUALNE ĆELIJSKE LINIJE?

1.Transformacijom ćelija in vitro

Različite tehnike – tretman ćelija mutagenima, virusima ili onkogenima; infekcija retrovirusima

2.Od tumorskih ćelija – kancerogeneza in vivo

Npr. HeLa ćelije tumora grlića materice, Namalwa ćelije tumora limfnih žlezda i dr.


Elijske kulture

KAKO SE DOBIJAJU ĆELIJE ZA GAJENJE U KULTURI ?

KOLEKCIJE ĆELIJSKIH KULTURA

“Banke ćelija” – veliki izbor dobro okarakterisanih ćelijskih linija

Suspenzija željenih ćelija se doprema poručiocu u zamrznutom stanju (na suvom ledu); po pristizanju u laboratoriju, ćelije se odmrzavaju i počinje kultivacija

Uz ćelije, dobija se i katalog sa svim potrebnim informacijama vezanim za uslove gajenja i “istoriju” date ćelijske linije


Elijske kulture

KAKO SE DOBIJAJU ĆELIJE ZA GAJENJE U KULTURI ?

Najveće i najpoznatije kolekcije, sa preko 3000 dobro okarakterisanih ćelijskih linija:

The American Type Culture Collection (ATCC), USA

www.atcc.org

The European Collection of Animal Cell Culture (EACC), UK

www.ecacc.org


Elijske kulture

KAKO ODRŽAVATI ĆELIJE U KULTURI ?

  • MEDIJUM

Kompleksan rastvor, sadrži različite komponente potrebne za normalan rast i metaboličku aktivnost ćelija.

Vrsta medijuma koja se koristi – specifično za svaku ćelijsku liniju

Tečni medijumi – (kupuje se napravljen, sterilan rastvor i kao takav se koristi)


Elijske kulture

KAKO ODRŽAVATI ĆELIJE U KULTURI ?

Medijumi u prahu

- prema odgovarajućoj recepturi, pravi se rastvor, podešava pH, i obavezno se steriliše filtriranjem kroz filter sa porama veličine 0.22µm.


Elijske kulture

KAKO ODRŽAVATI ĆELIJE U KULTURI ?

STANDARDNE KOMPONENTE MEDIJUMA

  • Ugljeni hidrati – najčešće glukoza kao osnovni izvor energije; riboza kao prekursor za sintezu nukleinskih kiselina; fruktoza

  • Aminokiseline – 0.1-0.2mM, kao prekursori za sintezu proteina; Glutamin: 2-4mM, prekursor intermedijera u TCA ciklusu;

  • Soli – izotoničnost rastvora

  • Vitamini i hormoni – u malim koncentracijama (µmol), kao metabolički ko-faktori; udeo i vrsta izuzetno variraju u zavisnosti od vrste medijuma tako da odgovaraju zahtevima ćelijskih linija za koje se dati medijum koristi


Elijske kulture

KAKO ODRŽAVATI ĆELIJE U KULTURI ?

  • Supstance za održavanje pH rastvora:

  • Bikarbonati (NaHCO3) – u kombinaciji sa CO2 u atmosferi (5-10%), omogućuje se održavanje pH na 6.9-7.4. Nedostatak: po vađenju iz inkubatora, pH može naglo da poraste

  • HEPES4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid )– 10-20mM; može da spreči porast pH; ćelije mogu da se gaje i u atmosferi bez CO2

  • Phenol red – indikator pH, osetljiv na vrlo male promene pH (okvirno: pH 6.5- žut, pH 7.0 – narandžast, pH 7.4 – crven, pH 7.8 – ljubičast medijum), postoje i formulacije bez ove komponente (takvi medijumi su bezbojni rastvori)


Elijske kulture

KAKO ODRŽAVATI ĆELIJE U KULTURI ?

DODACI MEDIJUMU

  • Serum – sadrži faktore rasta, neophodne za bolji rast i proliferaciju ćelija u kulturi

Najčešće se koriste fetalni teleći (fetal calf/bovine serum – FCS, FBS) ili konjski serum (fetal horse serum), zbog vrlo visokog sadržaja embrionalnih faktora rasta, zatim teleći serum dobijen od životinje stare 10 dana (newborn calf serum), teleći serum dobijen od životinje stare manje od 8 meseci (donor calf serum).

  • Udeo u medijumu najčešće 10% ili 5%

  • kupuje se kao sterilan, testiran na prisustvo mikroorganizama i nekih hemijskih jedinjenja


Elijske kulture

KAKO ODRŽAVATI ĆELIJE U KULTURI ?

  • Antibiotici – smanjuju rizik od kontaminacije

Penicilin (~ 100 IU/ml) – inhibira rast Gram+ bakterija

Streptomicin (~ 50-100 mg/l) – inhibira rast Gram+ i Gram- bakterija

Amfotericin (~25 mg/l) – antifungalni agens


Elijske kulture

KAKO ODRŽAVATI ĆELIJE U KULTURI ?

  • PRAĆENJE ĆELIJSKE KULTURE

ODREĐIVANJE BROJA ĆELIJA

U radu sa primarnim kulturama – određivanje broja izolovanih ćelija, određivanje vijabilnosti ćelijapravljenje suspenzije za sađenje sa odgovarajućim brojem ćelija,...

U radu sa kontinualnim kulturama – praćenje rasta i proliferacije ćelija, “pasažiranje” ćelija, pravljenje suspenzije za sađenje sa odgovarajućim brojem ćelija, ...


Elijske kulture

srednja vrednost broja ćelija u A-kvadratima

Broj ćelija/ml =

x Razblaženje x 10 000

broj živih ćelija

% vijabilnosti =

x 100

ukupan broj ćelija

Trypan Blue Exclusion Test – TBE Test

Neuber-ova komora

suspenzija ćelija

+ trypan blue (R)

Brojanje ćelija u A-kvadratima

Neuber-ove komore

Žive ćelije – neobojene

Mrtve ćelije - obojene plavo


Elijske kulture

...

~24h

Medijum se odliva, ćelije se ispiraju rastvorom tripsina dok se ne odlepe, broje se, i određeni broj prebacuje se u novi flask u kome će nastaviti svoju proliferaciju

KAKO ODRŽAVATI ĆELIJE U KULTURI ?

KONTINUALNE LINIJE – PASAŽIRANJE ĆELIJA

U zavisnosti od dinamike rasta ćelija i broja ćelija koji se pasažira, pasažiranje se obično radi jednom nedeljno.

Obavezna zamena medijuma svežim, svaka 2-3 dana !


Elijske kulture

KAKO ODRŽAVATI ĆELIJE U KULTURI ?

PROBLEM: KONTAMINACIJA

Vreme za koje se udvostruči broj ćelija:

sisarske ćelije ~24h

bakterijske ćelije ~30min

- prepoznaje se po promeni boje i/ili zamućenju medijuma

- bakterije, plesni, mikoplazma

ŠTA URADITI ?

- Kontaminirane kulture što pre ukloniti iz laboratorije, da kontaminacija ne zahvati zdrave linije

- U pojedinim slučajevima (npr. pri kontaminaciji mikoplazmom) moguće je “lečenje” kulture odgovarajućom kombinacijom antibiotika

- Identifikacija i eliminacija izvora kontaminacije


Elijske kulture

VAŽNO!

Ovo su bile neke osnovne informacije o radu sa ćelijskim kulturama.

Potrebno je stalno imati na umu da je svaka ćelijska linija priča za sebe, sa svojim posebnim zahtevima i

specifičnostima, koje je potrebno dobro

upoznati i proučiti kako bi gajenje u kulturi

bilo uspešno.


  • Login