1 / 173

İMMUNOLOJİK TANI YÖNTEMLERİ

İMMUNOLOJİK TANI YÖNTEMLERİ. Prof. Dr. Bekir KOCAZEYBEK. I- GENEL BAKIŞ;. KLİNİK İMMUNOLOJİDE HASTALIĞIN TANISI İÇİN Çok iyi bir ÖYKÜ alınması FİZİKİ İNCELEME yapılması Uygun TANI TESTİNİN yapılması ZORUNLUDUR. a)ÖYKÜ:.

nasnan
Download Presentation

İMMUNOLOJİK TANI YÖNTEMLERİ

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. İMMUNOLOJİK TANI YÖNTEMLERİ Prof. Dr. Bekir KOCAZEYBEK

  2. I- GENEL BAKIŞ; • KLİNİK İMMUNOLOJİDE HASTALIĞIN TANISI İÇİN • Çok iyi bir ÖYKÜ alınması • FİZİKİ İNCELEME yapılması • Uygun TANI TESTİNİN yapılması ZORUNLUDUR

  3. a)ÖYKÜ: KLİNİK İMMUNOLOJİ UZMANINA BAŞVURU NEDENLERİ(sıklık sırasıyla); • ENFEKSİYONLAR (en sık) Yineleyen enfeksiyon  Çocuklarda bulaşıcı ÜSYE çok sıktır  Bu çocuklarda sekonder olarak ♣ Otit, sinüzit, bronşit gelişebilir  Bu hastalıklar diğer çocuklara görülmesine göre daha sıksa ♣Antibiyotik almayı gerektiriyorsa Ig G alt sınıf yetersizliği vardır  Deri ve ÜSYE’nin; ♣6-12 aydan sonra başlaması ♣Sık ve birincil olması Ig yetersizliğini gösterir

  4. Çok ağır enfeksiyonlar  Ağır viral enfeksiyonlar T hücre yetersizliği  Ağırbakteri enfeksiyonlar B hücre yetersizliğini gösterir Fırsatçı mikroorganizmalarla enfeksiyon  Hastane enfeksiyon etkenleri  KİT’ de CMVenfeksiyonu Doğal ve özgül immunitede ♣Özellikle T hücre bozukluğu

  5. Kendine özgü mikroorganizmlarla enfeksiyon  Aspleniklerde Pnömokokenfeksiyonu Enflamasyonsuz enfeksiyon  Aplastik anemi, nötropenik ve disfonksiyonel nötrofiliklerde Pyojenik bakterilere dirençsizlik Kronik enfeksiyon  Kronik ishal yada büyüme bozukluğu olanlarda sIgA yada T hücre yetersizliği ♣ Rotavirus, G. lamblia enfeksiyonu

  6. İMMUN YETERSİZLİĞE BAĞLI; HASTALIK BELİRTİLERİ Allerjik Artrit  Deri değişiklikleri • MALİGN HASTALIKLARLA İLGİLİ BELİRTİLER

  7. b)FİZİKİ İNCELEME: • Hastada enfeksiyon bulunup bulunmadığı; VARSA;  Hastanın genel yanıtı, sağlık durumunun gözlenmesi • Hastalarda;  Solgunluk  Kanama odakları  Deride kolay morarma  Döküntü • Hastanın;  Lenf bezleri ve bademcikleri var olup olmadığı  Büyüklüğü saptanmalıdır  Ağır T hücre yetmezliğinde lenf bezi ele gelmez  Bademcikler görünmez

  8. Normal bebeklerde dalağın alt ucu ele gelir  Ancak dalak yokluğu (aspleni ile) Bakteriyel (kapsüllü) enfeksiyonlar sıktır • Ağızda pamukçukların olması  T hücre yetersizliği  Candida sp • Bazı özel sendromlara spesifik;  Hastalık ve/veya bulguların olması Di George sendromunda  Neonatal tetanoz ve KKH  Wiskott-Aldrich sendromu  Egzama  Kolay kanama eğilimi  Peteşi

  9. c)TANI TESTLERİ: • UYGUN TANI TESTİ NE DEMEK?  Hastanın kliniğine paralel doğru seçilmiş  Laboratuvar da özenle yapılmış  Sonucu titizlikle açıklanmış testtir

  10. UYGUN TANI TESTİ İSTEMENİN NEDENLERİ İmmun sistem çevre ile dinamik bir dengede olduğu için;  Çoğu testin spektrumu geniştir  İmmunolojik testlerin BAZILARI; BİOASSAY (yaşam sürecinde inceleme) olduğundan  Test sırasında kontrol edilemeyen değişken faktörlerden etkilenirler  Bundan dolayı testler ♣Aynı yaş ve zamanda Hasta ve kontrol gruplarında yapılmalıdır

  11. Bazı testler ilgili laboratuvarda az yapılır Bundan dolayı  Bu birim sürekli nitelik kontrolü yapması gerekir Test sonuçları  Klinik durumla paralel açıklanması gerekir ÇÜNKÜ;  Başka ikincil hastalıklar Veyametabolik bozukluklar sonuçları etkiler İmmunolojik testler  Özel araç- gereç ve uzman ekipmanlı laboratuvarlar gerektirdiğinden pahalıdır

  12. IMMUNOLOJİK TESTLERDE KLİNİK ÖRNEKLER • Venöz damardan kan alınabilir • Mikrobiyal antijen tayini ile ilgili • Serum, dışkı, balgam, idrar, • Boğaz salgısı, BOS, PMNL • Diğer enfekte doku, salgı ve sekresyonlar • Humoral immuniteyle (antikor tayini) ilgili Serum (antikoagulansız kan) • Hücresel immuniteyle ilgili  Heparinlenmiş taze kan ve eriyik maddeler İnvivo uygulamalar (cilt testleri) • İmmuno genetik çalışmalarla ilgili Kan örnekleri Taze veya fikse edilmiş dokular

  13. ENFEKSİYON HASTALIKLARININ TANISINDA • İmmunolojik (Serolojik) Testler ♦Enfeksiyon hastalığının tanısına sıklıkla indirekt, (bazende direkt) yardımcı olurlar ♦ Çeşitli klinik örneklerde mikroorganizmalara özgül antijen (Ag) veya antikorları (Ab) arama testleridir ♦ Ag araştıran testlerde duyarlılık erken ve tedavi edilmeyen durumlarda yüksektir ♦ Ab araştıran testlerde primer immun yanıt 7-21 gün içinde geliştiğinden çok erken evrede yalancı negatif olabilir ♦ Erken tedavi edilen ve bağışıklık yetmezliği olan olgularda antikor yanıtı gelişmemektedir

  14. ♦ Bu testler Ag-Ab birleşme temelli testlerdir ♦ Bu testler duyarlılığı ve özgüllüğü farklı YÖNTEMLERLE invitro olarak yapılmaktadır ♦ Bu yöntemlerin ANALİTİK duyarlılığı farklıdır • Hücresel İmmun Yanıt (Fakültatif yada zorunlu H.İ.B) gelişir • İnvivo deri testleri • İnvitro sentezlenen Quanteferon miktarı ya da Quanteferon sentezleyen hücre miktarı ölçülür.

  15. İmmunolojik yöntemlerin analitik duyarlılıkları (µg/ml- ng/ml)

  16. Presipitasyon

  17. MİKROBİYAL ENFEKSİYONLARDA SEROLOJİK(İMMUNOLOJİK) YÖNTEMLERİN AMACI(I) 1- TANIDA; • ÖRNEĞİN; VİRUSLARIN TANIMLANMASINDA; ♦ Kültürle izolasyonu; • Olanaksız, güç veya uzun zaman aldığından • örneğin HIV enf uygun hayvan yok • Tam donanımlı laboratuvarlar ve deneyimli elemanlar gerektirdiğinden • Virus izolasyonu için uygun örnek almak, transport etmek, saklamak hususlarındaki sorunlardan dolayı • RUTİN TANIDA PRATİK DEĞİLDİR

  18. VİRUS ENFEKSİYONLARINDA SEROLOJİK(İMMUNOLOJİK) YÖNTEMLERİN AMACI(I) *Viruslerinmikroskobisinde; -EM ve inklüzyon cisimciği aranmasının pratikte kullanımı sınırlı, zahmetli ve pahalı olması -Subjektif değerlendirmelere (deneyimli eleman) açık olması, yalancı pozitiflik ve negatiflikler olabilir

  19. VİRUS ENFEKSİYONLARINDA SEROLOJİK(İMMUNOLOJİK) YÖNTEMLERİN AMACI(I) ♦Viralnükleik asidin saptanmasında; -Moleküler Yöntemlerin *Her sağlık merkezinde uygulanamaması * Uygulandığı laboratuvarlara teknik donanım yetersizliği ve deneyimli ekipman azlığı * Her virus için deneysel olarak optimize edilememesi -Yalancı pozitif ve negatiflik sorunu * Her virus için uygulamasının olmaması - Özgül primer sorunu

  20. Mikrobiyal Enfeksiyonlarda İmmunolojik (serolojik) Test Yöntemlerinin amacı; • ÖRNEĞİN; • BAKTERİYAL ETKENİN TANIMLANMASINDA • İzolasyonun olanaksız, güç veya zaman gerektirdiği durumlar; • Lepra, Sifiliz, Brucelloz, Tularemi • Derin yerleşimli bir enfeksiyonda örneği elde etmek veya üretmede zorluk; • Coxiella endokarditinde endokard örneği almak veya kanda üretme zorluğu • Legionella, Chlamydophila, atipik pnömosinde BAL yada NFS almak veya üretme zorluğu • Geçirilmiş bir enfeksiyon veya taşıyıcılık durum belirlemede: • ARA veya AGN’ de ASO düzeyi • Tifo’da Anti-Vi varlığı

  21. MİKROBİYAL ENFEKSİYONLARDA ETKENİ TANIMLAMADA SEROLOJİK (İMMUNOLOJİK) DEĞERLENDİRME KRİTERLERİ (I) Antikor tayin temelli dört kriter vardır a)Tek bir serum örneğinde; Yüksek titrede spesifik IgMyanıtı -Rubella IgM, M.pneumoniae IgM  Veya IgM negatif IgG pozitif ise;  Akut-konvelasan dönem (2-3 hafta sonra) serumda 4 kat titre artışı -EBV IgG, C. pneumophila IgG ≥512 b)Akut ve konvelasan dönem (2-3 hafta) serumda 4 kat titreartışı Total antikor yanıtında  Paul Bunnel testi (EBV) Bruselloz tanısında Wright Testi  1/20den > 1/160 c) Nadir görülen enfeksiyonlarda;  Tek serum örneğinde Özgül IgM antikor yanıtı Kuduz, Botulismus

  22. d)IgG AVİDİTE TESTLERİ AFİNİTE:Multivalan bir antikorun monovalan bir antijenle bağlanma kuvveti AVİDİTE:Multivalan bir antikorun multivalan bir antijenle bağlanma kuvveti

  23. Primer ve sekonder enfeksiyon ayırımında kullanılır Olası Serolojik Profiller IgG (-) IgG (+) IgG (+) IgM (+) IgM (-) IgM (+)    Yeni Önceden Kazanılmış Geçirilmiş ve enfeksiyon Kazanılmış Bağışıklık

  24. BU DURUM; • Re-enfeksiyonlarda • Toplumda yaygın dolaşan viruslar; • CMV, HSV gibi • Re-aktivasyonlarda • CMV, HSV, EBV, VZV gibi latent viruslar • Akut ve Subklinik Enfeksiyon Sonrası Uzamış SerokonversiyondaGÖRÜLEBİLİR • Toksoplazmoz

  25. IgG AVİDİTE TESTLERİNDE PRENSİP (I) • Primer enfeksiyonlarda viruse özgül IgG aviditesi düşük; • Sekonder enfeksiyonlarda Yüksek • Re-enfeksiyon/aktivasyon • Primer enfeksiyonlarda oluşan antikorlar zaman ilerledikçe(>4 ay), olgunlaşır ve antijenlere bağlanma gücü artar • Bunun nedeni; • Yüksek aviditeli B lenfositlerin seçilmesindendir • İMMUNOKOMPETAN KİŞİLERDE AVİDİTE OLGUNLAŞMA SÜRELERİ • CMV  4 ay • RUBELLA  2 ay • TOXOPLASMA  6 ay • EBV  2.5 ay • HIV  6 – 12 ay

  26. IgG AVİDİTE TESTLERİNDE PRENSİP (II) • Hamile kadınların; • CMV, Rubella konjenital enfeksiyonlarında; • Primer ve sekonder enfeksiyon ayrımında önemlidir • Enfeksiyon primerse konjenital geçiş yüksektir • Sekonder ise virusun geçişi düşüktür • Immunsuprese Olgularda • CMV, EBV ve HHV-6 enfeksiyonların primer yada sekonder ayrımında kullanılır

  27. ETKENİ TANIMLAMADA ANTİJEN TAYİNİ: Duyarlılığı ve özgüllüğü yüksek tanı yöntemleriyle • Doğru yerden ve uygun şekilde alınan örneklerde Ag tayini • PMNH / pp65’in IF ile CMV tanısı • Serum örneklerinde HBsAg’nin EIA ile HBV tanısı • C.trachomatis Ag tayini ancak epitel hücre içeren üretral yada endoservikal sürüntü yada akıntı • H.pylori HpsA tayininde fazla sulu yada katı olmayan dışkı

  28.  Ag Tayininin Yapıldığı Durumlar; • İzolasyonda(Kültür) sorunlar • Kültürde zor üreyen bakterilerin tanısında; • Örn: - C. trachomatis - L. pneumophila • Kültürü geciken yada uzun süren mikroorganizmaların tanısında; • Bakteriler - H.pylori • Viruslar - CMV/pp65 • Parazitler - E. granulosus • Mantarlar -C. neoformans

  29. Kısa sürede, hızlı tanı konulması gereken ACİL-CİDDİ durumlarda; • Özellikle mikrobiyal menenjit tablosunda • Örn: S.agalactia yenidoğan menenjiti • Tonsillofarenjit • S.pyogenes • Toksijenik Ag’lerin tayini ile Bakteriyolojik Tanısında • C. difficile • Karışık ortamlardaki bakterilerin hızlı tanısında • Campylobacter • İndirekt bakteriyal tür tanısında • Shigella spp

  30. Immunolojik(Serolojik) tanı neleri amaçlar?(II) 2. Enfeksiyon hastalığını doğrulama  Direkt Aglutinasyon Testi -Kültürde üreyen bakterinin antijenine karşı hasta serumundaki antikor yanıtının saptanması  M.tuberculosis enfeksiyonunda Quanteferon testi  HIV’ de EIA ile Anti- HIV’ in WB ile doğrulanması • Bir kişinin ya da toplumun bağışıklığını saptama Anti-HAV IgG,  Anti-HBs 4. Etkenlerin serogrup, serotip veya immunotiplendirilmesi E. coli’de ETEC, EPECgibi 5. Hastalığın prognozu  HAV IgM yanıtı,  HBV’de hepatitbelirteçleri

  31. Serolojik(İmmunolojik) Tanıda Klinik Örnek Uygunluğu • Serum, plazma, plevra-periton-eklem sıvısı, BOS ve doku kesitleri • Ab Arama amaçlı serumun eldesi aseptik koşullarda olmalı ve Hemolizli,lipemik, fibrinliolmamalı • Ag Arama temelli klinik örnekler; CMV/ pp 65 PMNH bakılabilir RSV/Ag Nazofarengiyal yıkama suyu veya aspirat • Serolojik testler test kuralına göre çalışılmalı Örneğin:Soğuk aglütinasyon • Taze serumla çalışılmalı, Çalışılamıyorsa; Testlerin özelliğine göre 40C, -22, -40, -700C’ de saklanmalı • Serumlarda dondurma ve çözme işlemi bir kez yapılmalı • Bazı hastalıklarda kan alım aralığı önemli Örneğin:HIV’de ortalama 1.5 ay sonra

  32. Serolojik Tanıda İnvitro Test PrensipleriIgG’nin moleküler yapısı

  33. Antijen (Ag)- Antikor (Ab) birleşmesinin özellikleri • Antijen-antikor birleşmesi kimyasal bir reaksiyondur • Çünkü ısı açığa çıkar • Özgül bir reaksiyondur • S. flexneri‘ye karşı hazırlanan Ab • S. dysenteria ile birleşmez • Geriye dönüşür bir reaksiyondur • Ag+AbAgAb • Ag ile Ab arasında meydana gelen denge K ile gösterilen denge sabiti ile açıklanır • K=(AgAb) / (Ag) (Ab) • K ne kadar yüksek olursa birleşme o kadar özgüldür.

  34. Antijen ve antikor uygun oranlarda biraraya getirildiğinde maksimum reaksiyon oluşur • İki safhalı reaksiyondur: 1. safha; -Çok kısadır, Gözle görülmez -Elektrolitlere gereksinim yoktur 2. safha; - Uzundur, gözle görülür. - Elektrolitlere gereksinim vardır. - Isı ve nötral pH reaksiyonu hızlandırır

  35. Antijen-antikor birleşmesinde rol oynayan kuvvetler 1- Elektrostatik kuvvetler - Ag ve Ab moleküllerinin yüzeyinde birbirine zıt yüklü yapıların birbirini çekmesidir - Bu hücrelerdeki çekme gücü 2 molekül arasındaki uzaklığın karesi ile ters orantılıdır. F=(1/d2) -Bu kuvvetler Ag ve Ab birbirine yaklaştıkça artar - Örneğin NH+ grubu ise iyonize COO- grupları birbirine çeker. 2-     Hidrojen bağları -Hidrofilik gruplar arasında meydana gelen bağlardır -Zayıf ve geriye dönüşümlü bağlardır -Bu bağların oluşmasında iki molekülün birbirine yaklaşması gerekmektedir.

  36. 3-     Hidrofobik bağlar - Bu bağlar 2 molekülün birbirine yaklaşması sırasında su moleküllerini iterek birleşmesinde etkendir 4-     Van der Walls kuvvetleri - Bu kuvvetler Ag ve Ab molekülünü saran elektron bulutları ile ilgili kuvvetlerdir. - Bu kuvvetlerin etkinliği için Ag ve Ab moleküllerinin birbirine çok yaklaşmaları gerekir. - Bu kuvvetlerin etkinliği Ag ve Ab arasındaki uzaklığı 7 ile ters orantılıdır  F=1/d7

  37. SEROLOJİK TEST YÖNTEMLERİ1)PRESİPİTASYON; • Çözünür haldeki antijen ve özgül antikorların  Optimum konsantrasyonda karıştırılması ve  Birleşmesine bağlı gelişen reaksiyona denir  Reaksiyon sonucu  Kompleks (presipitat)gözle görülür  Birkaç dakikadan,1-2 güne kadar uzayabilir • Reaksiyonda  Optimum Ag ve Ab miktarı önemlidir AYRICA;  PH, elektrolit ve ısı da önemlidir

  38. Presipitasyon reaksiyonları; Pasif difüzyon şeklinde  Sıvı ortamda difüzyon  Halka ve kapiller tüp N. menengitidis, S. pneumoniae, H.influenzae Ag Jel (agar)ortamda difüzyon Tek yönlü difüzyon Quidin tüp dif.  Çeşitlivirus ve bakteri Ag belirlenmesinde kullanılır Radyal, Mancini plak dif.  CRP, serum Ig ve kompleman düzeyleri ♣Türbidimetrik ve nefolometrik cihazlar geliştirilmiştir ♣ Çok sayıda kan değerlendirilmesi için Çift yönlü (quchterlonoy plak) difüzyon Aspergilloz, histoplasmoz, blastomikoz Ag’lerin belirlenmesinde Immuno-double diffusion

  39. ■ ELEKTRO- İMMUN DİFÜZYON Elektrikli ortamda;  Antijenler elektriksel alanda ayrılırlar (elektroforez)  Elektroforez için değişik matriksler;  Kağıt  Sellüloz asetat  Agar  Poliakrilamid kullanılır  İmmun difüzyon ve elektroforezin birleştirilmiş tekniğine İMMUNELEKTROFOREZ denir Serum proteinlerinin tanımlanmasında Ig sınıfları ve ağır, hafif zincirlerdeki anormalliklerin saptanmasında  Basit, tek yönlü (laurell)(roket elektroforezi) ♣Titresi bilinmeyen bir antijenin titresini belirler  Karşıt( zıt yönlü) IEF ♣HBVAg ve Ab saptanmasında ♣Septik menenjit, pnömoni, septik artrit vb etken Antijen saptanmasında

  40. 2) AGLUTİNASYON: • Doğal olarak antijen taşıyan Bakteriler, Eritrositler, Lökositler • Yüzeylerinde yapay olarak antijen bulunan  Eritrosit, Latex, Bentonit  Polistren gibi sentetik parçacıkların  Elektrolitli bir ortamda Taşıdıkları antijenlerle,  Spesifik antikorların ♣Kümeleşme yaparak çökmesine denir • Lamda, tüpte mikroplaklarda yapılırlar • İkiye ayrılır  Aktif aglutinasyon  Pasif aglutinasyon

  41. AKTİF AGLUTİNASYON; DİREKT  Aglutinasyonda rol alan antijen partikülün kendisidir  Bakterilerin antijenleri Gruber- Widal, Wright, WF  Kan grubu antijenleri  Aktif hemaglutinasyon ♣ABO, Rh, Vd  Forward  Reverse ♣Cross-Matching  Major  Minor ♣Soğuk aglutinasyon  M.pneumoniae ♣Paul- Bunnel EBV

  42. AKTİF AGLUTİNASYON; İNDİREKT  Antijen ve antikorun bağlanmasında ikincil bir antikorun kullanılması  Antiglobulin Ab (tavşan kaynaklı - ticari) Direk Coombs ♣ Eritroblostasis fetalisli çocukların eritrosit yüzeyindeki Ab saptanır İndirekt Coombs ♣ Rh (-) annenin serumdaki Anti-Rh Ab’ler saptanır

  43. Reaksiyon güçlendiriciler A H G (Anti Human Globülin)

  44. PASİF AGLUTİNASYON • ANTİKOR (Ab) ARANIYORSA  Aglutinasyonda rol alan antijenler  Polisakkarit veya Proteinler (tannik asitle)  Eritrosite bağlanırsa ♣HEMAGLUTİNASYON VZV, Rubella, CMV, T.gondii Latex partikülleri, bentonit, kömür vb

  45. PASİF AGLUTİNASYON • ANTİJEN (Ag) (TERS PASİF) ARANIYORSA;  Eritrosit, latex, bentonit, kömür S.aureus covan 1 Antikorun Fc’sine bağlanır Latex Agg (LA) Ko Agg (CoA) ♣ Serum, BOS, idrarda  Bakteriyal polisakkarit Ag’leri N.menengitidis Hib S.pneumoniae C.neoformans Streptokokgruplandırılması, S.aureuskoagulaz deneyi  Çeşitli bakteri ve virusta ag tayinleri

  46. Hemaglutinasyon- inhibisyon (HI) testi Hemaglutinasyonu engelleyici antikorların saptandığı testtir  Hastanın serumu seri dilusyon edilir  Üzerine standardize sabit virus antijeni konulur Eritrositler eklenir  Serumda Ab’ler varsa  Hemaglutinasyonun görülmediği son titre pozitif sonuçtur İnfluenzae, Kabakulak, Rubella enfeksiyonlarında

  47. 3)KOMPLEMAN BAĞLAMA TESTİ • Antijen ve antikor birleşmesinin komplemanı uyarmasına dayanarak geliştirilen iki basamaklı testtir • Antikor (sıklıkla) ve antijen saptayabilen yarı kantitatif bir yöntemdir • Test birbirinden farklı üç komponent içerir Test sistemi  Hasta serumu (inaktif/aranan Ab)  Antijen (bilinen) KOMPLEMAN(kobay veya tavşan serum) İndikatör sistemi (hemolitik sistem)  Koyun eritrositleri  Koyun eritrositlerine karşı Ab

More Related