La chromatographie analytique
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La chromatographie analytique :. Phénomènes physico-chimiques liés à la séparation chromatographique. A. Van Camp. Plan Général. Les forces intermoléculaires Solvants usuels en LC Phases stationnaires usuelles en GC Les phases stationnaires polaires en LC

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La chromatographie analytique :

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Presentation Transcript


La chromatographie analytique

La chromatographie analytique :

Phénomènes physico-chimiques

liés à la séparation chromatographique.

A. Van Camp


Plan g n ral

Plan Général

  • Les forces intermoléculaires

  • Solvants usuels en LC

  • Phases stationnaires usuelles en GC

  • Les phases stationnaires polaires en LC

  • Les phases stationnaires inverses en LC

  • L'échange d'ions

  • La perméation de gel ou l'exclusion stérique.


La chromatographie analytique

Les forces intermoléculaires en jeu

Les partenairesde la séparation

Phase stationnaire = PS (parfois appelée support)

Phase mobile = éluant = PM

GC : gaz

LC : liquide

Les constituants du mélange à séparer = m1, m2, ...


La chromatographie analytique

Les forces intermoléculaires en jeu

> 0

0

< 0


La chromatographie analytique

Les forces intermoléculaires en CL

Equilibrechromatographique :

En chromatographie liquide :

Force intermoléculaire

Force intermoléculaire


La chromatographie analytique

Les forces intermoléculaires en GC

Seule force intermoléculaire en jeu

PM = N2, He, H2


La chromatographie analytique

Les forces intermoléculaires

Forces de dispersion de London :

Molécules apolaires

d+

d-

d+

d-

  • attraction entre dipôles instantanés

  • interaction présente dans tous les composés

  • n'intervient qu'à très courte distance

  • importance augmente avec la polarisabilité du nuage électronique


La chromatographie analytique

Les forces intermoléculaires en jeu

Forces de Keesom :

attraction entre dipôles permanents

d-

d+

d-

d+

d-

d+

Molécules polaires

d+

d-


La chromatographie analytique

Les forces intermoléculaires en jeu

Forces de Keesom :

attraction entre dipôles permanents

n'intervient qu'à très courte distance

Forces de Debye :

attraction entre dipôle instantané et dipôle permanent

n'intervient qu'à très courte distance


La chromatographie analytique

Les forces intermoléculaires en jeu

X et Y = F, O ou N

donneur

  • Pont Hydrogène :

    • attraction de type Keesom entre un H lié à un atome électronégatif et un autre atome électronégatif.

    • interaction possible à plus longue distance

accepteur


La chromatographie analytique

Les forces intermoléculaires en jeu

  • Molécules apolaires :

    • toutes les liaisons unissent des atomes d'électronégativités similaires (C et H)

    • pas de dipôle permanent

    • seule force intermoléculaire : London


La chromatographie analytique

Les forcesintermoléculairesen jeu

  • Molécules apolaires :

    • il existe des atomes d’électronégativité différentes, mais il n’y a pas de dipôle permanent à cause de l’arrangement symétrique.

    • exemple : le CCl4

d-

d+

d-

d-

d-


La chromatographie analytique

Les forces intermoléculaires en jeu

  • Molécules polaires :

    • contiennent des liaisons entre atomes d'électronégativités assez différentes (C-O, C-N, O-H, N-H, …)

    • présence de dipôle permanent

    • forces de Keesom, Debye et London

    • éventuellement : ponts H


La chromatographie analytique

Les forcesintermoléculairesen jeu

  • Attraction électrostatique entre ions de signe contraire

  • Energie de « liaison » d’autant plus grande que le milieu est peu polaire (faible constante diélectrique)

  • Se rencontre :

    • Dans un cristal ionique

    • Paires d’ions dans un solvant (séparées ou non par le solvant)


La chromatographie analytique

Les forcesintermoléculairesen jeu

Énergie de «liaison»

Forces de dispersion de London

Debye

Keesom

Pont Hydrogène

Attraction entre ions de signes contraires


Plan g n ral1

Plan Général

  • Les forces intermoléculaires

  • Solvants usuels en LC

  • Phases stationnaires usuelles en GC

  • Les phases stationnaires polaires en LC

  • Les phases stationnaires inverses en LC

  • L'échange d'ions

  • La perméation de gel ou l'exclusion stérique.


La chromatographie analytique

Quelques solvants usuels en CL

d+

d-


La chromatographie analytique

T° éb.

Paramètre de polarité e0

Miscibilité à l’eau

Tétrahydrofurane (THF)

66°

0.53

oui

acétone

56°

0.53

oui

acétonitrile

81°

0.52

oui

isopropanol

82°

0.60

oui

éthanol

78°

0.7

oui

méthanol

64.5°

0.7

oui

eau

100°

élevé

oui !

Quelques solvants usuels en CL


La chromatographie analytique

Quelques solvants usuels en CL

Accepteurs et donneurs de pont H

Accepteurs de pont H


La chromatographie analytique

Quelques solvants usuels en CL

L'eau ! ! !

Forces de cohésion importantes :

tension superficielle élevée

eau : 73 mN/m

méthanol : 23 mN/m

viscosité élevée

eau : 0,89 cP

méthanol : 0,54 cP

température d'ébullition exceptionnelle

H2O (MM 18) : 100°C

NH3 (MM 17) : - 33°C

méthanol : 65°C

constante diélectrique très élevée

eau : 78

méthanol : 33


Plan g n ral2

Plan Général

  • Les forces intermoléculaires

  • Solvants usuels en LC

  • Phases stationnaires usuelles en GC

  • Les phases stationnaires polaires en LC

  • Les phases stationnaires inverses en LC

  • L'échange d'ions

  • La perméation de gel ou l'exclusion stérique.


La chromatographie analytique

Quelques phases stationnaires en GC

Polarité

croissante


La chromatographie analytique

Les forces intermoléculaires en GC

PM = N2, He, H2

Elution rapide de molécules "volatiles" non pas à l'état pur, mais dans l'état adsorbé sur la PS utilisée.

CH3OH sur diméthylsilicone (PS apolaire) se comporte comme une molécule "volatile". Son élution sur PS polyéthylèneglycol sera nettement plus lente.

En revanche, à l'état pur les molécules de CH3OH s'associent par ponts H : le composé possède un point d'ébullition relativement élevé.


Plan g n ral3

Plan Général

  • Les forces intermoléculaires

  • Solvants usuels en LC

  • Phases stationnaires usuelles en GC

  • Les phases stationnaires polaires en LC

  • Les phases stationnaires inverses en LC

  • L'échange d'ions

  • La perméation de gel ou l'exclusion stérique.


La chromatographie analytique

Les phases stationnaires polaires en LC

La silice : SiO2

Solide macromoléculaire

Caractéristiques du solide :

Forme des grains : sphérique ou irrégulière

Granulométrie: 1,7 à 10 µm de diamètre moyen (ou plus pour la chromatographie préparative)

Porosité : taille moyenne des pores ( 60 - 1000 Å); plus de 95% de la surface du solide se trouve dans le volume poreux.

Pureté

Groupes silanols en surface

Donneurs et accepteurs de pont H

Partiellement ionisés à partir d'un pH 3


La chromatographie analytique

Les phases stationnaires polaires en LC

Échange sur la PS

Interaction forte

Interaction forte

"Logique" d'élution : mode "normal"

Pour un éluant donné, les mi seront élués par ordre de polarité croissante.

Éluant puissant = éluant polaire, ayant une forte affinité pour la PS, tous les mi sont élués rapidement (non sélectif)

Éluant sélectif = éluant apolaire (alcanes)

Gradient = polarité croissante


La chromatographie analytique

Les phases stationnaires polaires

Pentane0,00

Hexane0,01

Toluène 0,22

Dichlorométhane0,30

Acétate d'éthyle0,48

MTBE0,48

Acétonitrile0,52

Tetrahydrofurane0,53

Méthanol0,70

Échelle de polaritée°

En pratique sur silice, un solvant polaire =dichlorométhane pur, acétate d'éthyle pur, un solvant contenant un faible %age d'alcool.


Plan g n ral4

Plan Général

  • Les forces intermoléculaires

  • Solvants usuels en LC

  • Phases stationnaires usuelles en GC

  • Les phases stationnaires polaires en LC

  • Les phases stationnaires inverses en LC

  • L'échange d'ions

  • La perméation de gel ou l'exclusion stérique.


La chromatographie analytique

Les phases stationnaires apolaires en LC

Modification chimique de la surface de la silice :

Phase inverse C18

Reversed Phase RP-C18


La chromatographie analytique

Autres phases stationnaires greffées

Modification chimique de la surface de la silice :

Autres "chimies" résultant de transformation des silanols de surface :

R = -C8H17 (RP C8)

-CH2CH2CH2-Phényl

-CH2CH2CH2CN

-CH2CH2OCH2CH(OH)CH2OH

-CH2CH2CH2NH2

etc ...

Phases polaires


La chromatographie analytique

Les phases stationnaires apolaires

"Logique" d'élution : mode "inverse"

Qui se ressemble, s'assemble ???


La chromatographie analytique

Les phases stationnaires apolaires

Interaction forte

Interaction forte

"Logique" d'élution : mode "inverse"

Pour un éluant donné, les mi seront élués par ordre de polarité décroissante.

Éluant puissant = éluant non aqueux, solubilisant bien les composés mi. Ils sont tous élués rapidement (non sélectif).

Éluant sélectif = éluant fortement aqueux, forte cohésion, où les composés mi sont faiblement solubles.

Gradient = polarité décroissante, teneur en eau décroissante.


La chromatographie analytique

PS

PM

Gradient d’élution

Ordre d’élution

Phase normale (NP)

très polaire

peu polaire

Polarité croissante

Exemple : hexane + proportion croissante d’acétate d’éthyle

Les moins polaires sont plus rapides

Phase inverse (RP)

apolaire

très polaire

Polarité décroissante

Exemple : H2O + proportion croissante de CH3OH

Les plus polaires sont plus rapides

Les phases stationnaires polaires et apolaires : comparaison.


Plan g n ral5

Plan Général

  • Les forces intermoléculaires

  • Solvants usuels en LC

  • Phases stationnaires usuelles en GC

  • Les phases stationnaires polaires en LC

  • Les phases stationnaires inverses en LC

  • L'échange d'ions

  • La perméation de gel ou l'exclusion stérique.


La chromatographie analytique

L'échange d'ions

  • Séparation et dosage d'ions. Exemples :

  • les nitrates dans l'eau

  • une protéine dans un liquide physiologique

Échange d'anions

résine faible : DEAE (diéthylaminoéthyl), amino

résine forte : ammonium quaternaire

Échange de cations

résine faible : -CH2COO-(CM, carboxyméthyl)

résine forte : -SO3- (sulfonique)

ex : SP = sulfopropyl


La chromatographie analytique

L'échange d'ions

Intervention omniprésente du pH !

Ka = 10-4, par exemple  pKa = 4

pH = pKa = 4 50% de HA, 50 % de A-

pH = pKa - 1 = 390% de HA, 10% de A-

pH = pKa - 2 = 299% de HA, 1% de A-

pH = pKa + 1 = 510% de HA, 90% de A-

pH = pKa + 2 = 61% de HA, 99% de A-


La chromatographie analytique

L'échange d'ions

Intervention omniprésente du pH !

Ka = 10-9, par exemple  pKa = 9

(càd : Kb = 10-5)

pH = pKa = 9 50% de BH+, 50 % de B

pH = pKa - 1 = 890% de BH+, 10 % de B

pH = pKa - 2 = 799% de BH+, 1% de B

pH = pKa + 1 = 1010% de BH+,90% de B

pH = pKa + 2 = 111% de BH+,99% de B


La chromatographie analytique

L'échange d'ions

Intervention omniprésente du pH !

résine

résine

résine


La chromatographie analytique

L'échange d'ions

Intervention omniprésente du pH !

CM, carboxyméthyl :

résine

résine

SP, sulfopropyl :

résine

résine


La chromatographie analytique

L'échange d'ions

R = résine

  • K dépend surtout de la nature des ions échangés : affinité relative de Cl- et OH- / Na+ et H+ dans les exemples ci-dessus

  • Deux facteurs :

    • la charge de l’ion (ex : Mg++ plus retenu que Na+)

    • pour une même charge, en phase aqueuse, c’est la taille de l’ion hydraté qui importe. F- et OH- (pour les anions), H+ et Li+ (pour les cations) ont des rayons hydratés très grands et sont peu retenus par la PS.


La chromatographie analytique

L'échange d'ions

Sur résine forte

R = résine

adsorption

élution

Les concentrations agissent sur la position de l’équilibre.

Une concentration élevée en ions, même de faible affinité, pourra éluer un ion fortement retenu.

Gradient d’élution : concentration croissante en ions.


La chromatographie analytique

L'échange d'ions

Sur résine faible

R = résine

adsorption

élution

Un tampon maintient le pH constant tout au long de la chromatographie. Il maintient une charge identique sur la résine.

L'ion du tampon utilisé, ayant le signe contraire à la charge de la résine, est présent au moment du dépôt de l'échantillon (conditionnement).

Gradient d’élution : concentration croissante en ions provenant d'un sel ne modifiant pas le pH (NaCl, par ex.)


La chromatographie analytique

L'échange d'ions

Appariement d’ions sur phase inverse

La PS C18 est conditionnée avec un éluant contenant un surfactant anionique. Il se fixe sur la PS et elle se comporte en échangeuse de cation.

Permet l’échange d’ions en phase organique.

Echange d'anion avec un détergent cationique :


Plan g n ral6

Plan Général

  • Les forces intermoléculaires

  • Solvants usuels en LC

  • Phases stationnaires usuelles en GC

  • Les phases stationnaires polaires en LC

  • Les phases stationnaires inverses en LC

  • L'échange d'ions

  • La perméation de gel ou l'exclusion stérique.


La chromatographie analytique

Perméation de Gel - Exclusion stérique

  • Séparation d'après la taille des molécules. Exemple de domaine d'application :

    • biopolymères tels que les protéines

    • polymères de synthèse

La phase stationnaire est poreuse : le liquide qui s'y trouve occupe un volume Vp, qu'on appelle le volume poreux.

La taille moyenne des pores est telle que certaines molécules n'ont pas accès à tout le volume poreux.

molécules

Un grain de PS


La chromatographie analytique

Perméation de Gel - Exclusion stérique

Volume interstitiel, en dehors des pores = volume mort V0

  • Volume total du lit chromatographique : Vt

  • Il est constitué de  90% de liquide :

    • Volume interstitiel, en dehors des pores = volume mort V0 ( 30%)

    • Volume poreux = Vp ( 60%)

Un grain

Vt  Vp + V0


La chromatographie analytique

Perméation de Gel - Exclusion stérique

La concentration d’une molécule dans le volume poreux dépend des tailles respectives du pore et de la macromlolécule.

Elle ne dépend pas d’interactions avec la PS ou la PM.


La chromatographie analytique

Perméation de Gel - Exclusion stérique

Exclusion totale

K = 0

Perméation totale

K = 1


La chromatographie analytique

Perméation de Gel - Exclusion stérique

Pour une molécule de taille donnée :

VRi = V0 + Ki . Vp

Fraction du volume poreux, accessible à la macromolécule i

0  K  1

Volume de rétention = volume de liquide sorti de la colonne jusqu'à l’élution de la macromolécule i

volume interstitiel accessible à toute molécule quelque soit sa taille


La chromatographie analytique

Perméation de Gel - Exclusion stérique

Pour une molécule de taille donnée :

VRi = V0 + K . Vp

Si on néglige le volume de solide dans le lit chromatographique :

Vp = Vt - V0


La chromatographie analytique

Perméation de Gel - Exclusion stérique

Pour des molécules de structure et de forme semblables, il existe une relation linéaire permettant d'établir des masses molaires (MM) moyennant un étalonnage avec des standards appropriés.

Perméationsélective


La chromatographie analytique

Perméation de Gel - Exclusion stérique

Deux phases stationnaires dont la taille moyenne des pores diffère.


La chromatographie analytique

En résumé

  • En GC

    • Eluant gazeux, interaction des constituants avec la PS

  • En LC :

    • PS polaires ou "normales": l'ordre d'élution des mi est l'ordre de polarité croissante, gradient d'élution de polarité croissante.

    • PS apolaires ou "inverses": l'ordre d'élution des mi est l'ordre de polarité décroissante, gradient d'élution de polarité décroissante (diminution de la teneur en eau).

    • Echange d'ion : élution par gradient de concentration ionique.

    • Chromatographie d'exclusion stérique. Pas de différences d'interactions des mi avec la PM ou PS. Séparation d'après la taille.

La plus utilisée !!!


La chromatographie analytique

Et ce n'est pas tout ...

Chromatographie sur PS chirale

Chromatographie d'affinité

Chromatographie avec fluide supercritique

Electrochromatographie

etc ...

Références générales très utiles :

" Principes d'analyse instrumentale" Skoog, Holler, Nieman, De Boeck 2003.

"Quantitative Chemical Analysis", D.C. Harris, Freeman, 6th Edition, 2003.


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