Analisi degli alimenti (LMC-2: CARBOIDRATI) Giorgio Bonaga

1. Analisi degli alimenti (LMC-2: CARBOIDRATI) Giorgio Bonaga Anno Accademico 2010/2011 Laurea Magistrale inCHIMICA

2. COMPOSIZIONE CHIMICA E ANALISIDEI CARBOIDRATI

3. MONOSACCARIDI: D-aldosi (+)-gliceraldeide (-)-eritrosio (-)-treosio (-)-ribosio (-)-arabinosio (+)-xilosio (-)-lixosio H H H (+)-allosio (+)-altrosio (+)-glucosio (+)-mannosio (-)-gulosio (-)-idosio (+)-galattosio (+)-talosio

4. MONOSACCARIDI: D-chetosi diidrossiacetone (-)-eritrulosio (+)-ribulosio (+)-xilulosio (+)-psicosio (-)-fruttosio (+)-sorbosio (-)-tagatosio

5. DISACCARIDI maltosio (4-O-a-D-glucopiranosil-b-D-glucopiranosio) cellobiosio (4-O-b-D-glucopiranosil-b-D-glucopiranosio) lattosio (4-O-a-D-glucopiranosil-b-D-galattopiranosio) saccarosio (1-O-a-D-glucopiranosil-b-D-futtofuranosio)

6. POLISACCARIDI AMIDO È il materiale di riserva energetica dei vegetali. È costituito dal polimero lineare amilosio (20%) e dal polimero ramificato amilopectina (80%). L’amilosio è una catena lineare, avvolta ad elica, di molecole di a-glucopiranosio unite con legami glucosidici di tipo a-1,4; le doppie eliche sono stabilizzate da legami a H. Nell’amilopectina la catena lineare ha anche delle ramificazioni di tipo a-1,6 con formazione di una struttura a grappolo. 1a punto di ramificazione 1a 6a 4a amilosio amilopectina

7. 1b 4b CELLULOSA È il componente principale delle fibre alimentari che derivano dal tessuto fibroso delle pareti cellulari dei vegetali. È una catena lineare di molecole di b-glucopiranosio unite con legami b-1,4 (b-cellobiosio). I legami a H si formano all’interno di una catena o tra due catene diverse. L’aggregazione di 50-100 molecole forma una fibrilla elementare (micella), quella di circa 20 fibrille elementari forma una microfibrilla e quella delle microfibrille una macrofibrilla. cellulosa macrofibrilla microfibrilla fibrille elementari

8. pectina Ca++ Ca++ emicellulosa estensina microfibrilla di cellulosa STRUTTURA DELLA PARETE CELLULARE DI UN VEGETALE

9. EMICELLULOSA È un altro componente del tessuto fibroso delle pareti cellulari dei vegetali ed è costituita da un polimero misto, di 20-100 molecole, ramificato, costituito da aldoesosi (glucosio, mannosio e galattosio) e aldopentosi (xilosio e arabinosio). Le molecole si legano prevalentemente con legami a-1,4, ma anche a-1,6 e a-1,3. La struttura dell’emicellulosa conferisce alla sostanza una spiccata idratabilità. ESTENSINA È una glicoproteina (glicano) nella cui catena proteica alcuni residui amminoacidici della idrossiprolina si legano a 10-100 molecole di zuccheri (glucosio, galattosio, xilosio, mannosio, fucosio). È questa struttura che determina l’elevata elasticità della estensina.

10. LIGNINA È un altro componente del tessuto fibroso delle pareti cellulari dei vegetali. È costituto da una complessa e variabile polimerizzazione di numerosi derivati del p-idrossifenilpropano.

11. GLICOGENO È il polisaccaride di riserva delle cellule animali del fegato e dei muscoli scheletrici. È costituito da catene lineari di glucopiranosio unite da legami glucosidici di tipo a-1,4 e da ramificazioni di tipo a-1,6. Il glicogeno ha dunque una struttura simile a quella dell’amilopectina, ma più ramificata. glicogeno

12. L’enzima a-1,4-fosforilasi idrolizza i legami a-1,4 delle catene lineari, liberando una molecola di glucosio (in forma di a-D-glucopiranosil-1-fosfato) per volta a partire dalle estremità terminali, fino al 4 unità di zucchero dal punto della ramificazione. L’enzima transferasi veicola 3 molecole di zucchero in coda all’altro ramo della ramificazione ed infine l’enzima a-1,6-glucosidasi stacca l’ultima molecola di glucosio con formazione di una catena lineare che, ora, può essere idrolizzata dalla a-1,4-fosforilasi. Le molecole di glucosio prodotte dal glicogeno formano, per glicolisi, acido piruvico. In ambiente aerobico l’acido piruvico viene ossidato a CO2+H2O ma, in ambiente povero di ossigeno, viene ridotto d acido lattico. Alcuni lieviti anaerobici lo convertono in etanolo (bioetanolo). +

13. REAZIONI ENZIMATICHE DEL GLICOGENO a-1,4-fosforilasi a-1,6-glucosidasi transferasi

14. CELLULA VEGETALE parete primaria (cellulosa, emicellulosa, lignina) lamella mediana (pectine, gomme) membranacitoplasmatica vacuolo nucleo amiloplasto cloroplasto amido parete secondaria (cellulosa, emicellulosa, cutina, suberina, lignina, CaCO3)

15. CELLULA ANIMALE (FEGATO) membranacitoplasmatica glicogeno

16. RUOLO BIOLOGICO DEI CARBOIDRATI 1a 4a CELLULOSA, EMICELLULOSA, ESTENSINA AMIDO E GLICOGENO elementi strutturali riserve energetiche

17. POLIOLI Sono composti poliossidrilici a 5 o 6 atomi di carbonio, diffusi in natura, ad azione edulcorante. D-(-)-sorbitolo D-(-)-mannitolo D-xilitolo D-(-)-ribitolo

18. C H O H 2 H O C H C H O H H C O H 2 O C H O H O H O C H C H O H 2 O H O H C H O H 2 H O C H C H O H C H O H 2 2 C H O H H C O H 2 H O H H O H O C H O H C H C H O H O H O H H O H 2 2 O O + H O H H O C H H O H O H H O H O H H O H C H O H O H O H 2 H O H O O C H O C H O H 2 2 O H O H POLIOLI (SINTETICI) Sono edulcoranti sintetici nei quali una molecola di monosaccaride è legata ad una molecola di un poliolo. Sono zuccheri ipocalorici, non-cariogeni. a-glucopiranosil-1,4-sorbitolo maltitolo a-galattopiranosil-1,4-sorbitolo lattitolo a a -glucopiranosil-1,1-D-mannitolo -glucopiranosil-1,6-D-sorbitolo (diidrato) (anidro) isomalto

19. CARBOIDRATI NEGLI ALIMENTI • L’Istituto Nazionale di Ricerca per gli Alimenti e la Nutrizione (INRAN) ha suddiviso gli alimenti nelle seguenti categorie: • Cereali e derivati • Legumi • Verdure ed ortaggi • Frutta • Carni fresche • Carni trasformate e conservate • Fast-food a base di carne • Frattaglie • Prodotti della pesca • Latte e yogurt • Formaggi e latticini • Uova • Oli e grassi • Dolci • Prodotti vari • Bevande alcoliche • All’indirizzo: http://www.inran.it, cliccando “Banche dati” e poi “Banca Dati di composizione degli alimenti”, si possono consultare le composizioni medie dei nutrienti di tutte le categorie di alimenti elencate.

20. CORNFLAKES • (100 g) • acqua 5,00 g • proteine 6,60 g • lipidi 0,80 g • carboidrati 87,30 g • amido: 70,0 g • zuccheri: 13,5 g • fibre: 3,8 g • minerali 0,24 g • Na: 11 mg • K: 99 mg • Ca: 74 mg • Fe: 3 mg • P: 58 mg • vitamina A 0,3 mg

21. CARBOIDRATI E POLIOLI IN MATERIE PRIME DESTNATE ALL’ALIMENTAZIONE UMANA • MONOSACCARIDI • glucosio frutta, verdura, ortaggi, miele, uva • fruttosio frutta, miele, uva • galattosio uva • DISACCARIDI • saccarosio frutta, canna da zucchero, barbabietola da zucchero, uva • lattosio latte, prodotti lattiero-caseari (formaggi, burro, yogurt) • maltosio cereali, frutta (datteri), tuberi (patata americana), miele • POLISACCARIDI • amido semi di cereali, legumi, tuberi, frutta (noci., castagne) • cellulosa frutta, legumi, verdure, ortaggi, soia • POLIOLI • sorbitolo frutta (mele, pere, prugne, ciliegie, sorbo), bacche, alghe • mannitolo alghe, funghi, betulla, frassino da manna • xilitolo frutti di bosco (fragole, lamponi), frutta (prugne), ortaggi

22. ANALISI DEI CARBOIDRATI NEGLI ALIMENTI La determinazione qualitativa e quantitativa dei carboidrati è importante per 5 motivi: • controllo della qualità delle materie prime, dei semilavorati e dei prodotti finiti; • controllo della genuinità degli alimenti; • controllo della conformità degli alimenti rispetto le leggi vigenti; • identificazione di dolcificanti, addensanti, surrogati dei grassi negli alimenti; • monitoraggio del processo di fermentazione (conversione degli zuccheri in etanolo ad opera dei lieviti) nella produzione di bevande alcoliche. Le maggiori performances della HPLC rispetto quelle ottenute con la GC hanno determinato, specialmente negli ultimi anni, la sostituzione quasi completa della gascromatografia con la cromatografia liquida.

23. 1. PREPARAZIONE DEL CAMPIONE I campioni da analizzare possono essere di natura talmente complessa (prodotti lattiero-caseari, succhi di frutta, ecc.) da richiedere 2 steps: estrazione e purificazione a) ESTRAZIONE Viene fatta un’estrazione liquido-liquido evitando l’acqua come unico solvente perché estrarrebbe una grande quantità di composti polari (amminoacidi, proteine, acidi liberi a basso peso molecolare, ecc.). Nel caso dei carboidrati a maggior peso molecolare l’estrazione più comune impiega EtOH/H2O o MeOH/H2O (80/20) ad alta temperatura (a reflusso) o a temperatura ambiente, per un numero di volte (4-5) sufficienti ad estrarre tutti i carboidrati dalla matrice (assenza rivelata con saggio colorimetrico).

24. b) CLEANUP • Numerosi fattori condizionano la scelta della procedura di purificazione: • solvente di estrazione • concentrazione di carboidrati presenti in relazione alle sostanze interferenti • complessità della matrice di partenza • Le procedure più frequentemente utilizzate nell’analisi dei carboidrati sono: • 1. AGENTI CHIARIFICANTI • L’obiettivo è di fare precipitare le proteine e/o gli acidi grassi liberi che potrebbero sovrapporsi ai carboidrati. L’eccesso di chiarificante deve essere rimosso perché può interferire nella HPLC. È il caso dell’acetato di piombo, molto utilizzato nell’analisi tradizionale degli zuccheri, il cui eccesso viene eliminato mediante cromatografia di scambio ionico. • 2. PRECIPITAZIONE CON SOLVENTI • Quando il solvente di estrazione è soltanto acqua, l’estratto contiene anche composti polari (sali, amminoacidi, ecc.) che vengono fatti precipitare, ad esempio, con una miscela di (CH3COO)2Pb/CH3CN.

25. Anche le macromolecole idrosolubili che possono interferire con gli zuccheri vengono rimosse per semplice precipitazione con un solvente organico, per esempio CH3OH, sebbene una parte di carboidrati rimanga adsorbita sul materiale precipitato, con una conseguente perdita di analiti. L’ CH3CN viene impiegato nell’analisi dei mono- e disaccaridi nel latte e nei prodotti lattiero-caseari, ma in generale è il solvente organico più utilizzato nelle determinazioni degli zuccheri negli alimenti. 3. SCAMBIO IONICO Negli alimenti possono essere presenti specie ioniche a basso ed elevato peso molecolare che si trasferiscono nell’estratto idroalcolico. Il rischio di picchi di overlapping è considerevole quando sono presenti sali e amminoacidi, che eluiscono con tempi di ritenzione molto simili a quelli dei carboidrati, mentre le proteine possono legarsi irreversibilmente alla fase stazionaria, con conseguente più rapido deterioramento della colonna cromatografica. In questi casi è sufficiente l’impiego di una resina a scambio ionico che consente la rimozione di tutte le specie interferenti, ma non dei carboidrati. Questa purificazione è adottata nell’analisi dei prodotti a base di frutta (vini e succhi di frutta) perché non rimuove soltanto le proteine e gli amminoacidi, ma anche gli acidi organici (tartarico, malico, succinico, lattico, citrico, ecc.)

26. 4. SPE La silice funzionalizzata C18 (Sep-Pak) è un altro frequente metodo di purificazione dell’estratto. Le cartucce per la “Solid Phase Extraction” vengono utilizzate nella purificazione degli estratti ottenuti da matrici molto complesse (cereali e derivati, latte e derivati, ecc.), anche in considerazione del costo relativamente elevato di una cartridge (~ 5 €). 5. PRECOLONNA (Guard Column) Una precolonna di 4-6 cm., narrow bore (2,0-2,5 mm) impaccata con una fase stazionaria pellicolare, è in grado di trattenere i composti con una selettività che dipende dal maggiore o minore carattere idrofobico della fase stazionaria. La precolonna è utilizzata in alternativa od anche in accoppiamento con la SPE. 6. COLUMN SWITCHING È l’accoppiamento di 2 colonne di tipo diverso: nella prima, basata sulla filtratione su gel, eluisce l’estratto totale, i cui costituenti si separano in funzione della dimensione molecolare; nella seconda, basata sulla cromatografia di partizione, viene introdotta ed eluita soltanto la frazione dei carboidrati a basso peso molecolare.

27. COLUMN SWITCHING gel filtration column DETECTOR impurezze partition column carboidrati

28. 2. TECNICHE HPLC • La grande varietà di fasi stazionarie disponibili sul mercato consente di utilizzare diverse tecniche HPLC: • FILTRAZIONE SU GEL • A causa dei tempi eccessivamente lunghi e della scarsa risoluzione, la GFC viene utilizzata quasi esclusivamente nell’analisi dei polisaccaridi. • b) CROMATOGRAFIA DI SCAMBIO IONICO • Le resine a scambio anionico e cationico sono state molto utilizzate in passato; oggi, causa dei tempi eccessivamente lunghi dell’analisi e della necessità di operare a temperature elevate, si è imposta la cromatografia di partizione a fase legata. • c) CROMATOGRAFIA DI PARTIZIONE • NPC con silice funzionalizzata NH2 (3-amminopropiltrietossisilano), e fase mobile CH3CN/H2O. Questa tecnica è molto selettiva per i mono- e disaccaridi, ma comporta la formazione di basi di Schiff con i gruppi carbonilici degli zuccheri che rendono instabile la fase stazionaria. • RPC con silice funzionalizzata C18 e fase mobile H2O. Questa tecnica è poco efficace per i mono- e disaccaridi, ma è ideale per la separazione degli anomeri degli oligosaccaridi.

29. 2. RIVELATORI a) A LUCE ULTRAVIOLETTA (UVD) Le lunghezze d’onda a cui i carboidrati mostrano una assorbanza accettabile (190-210 nm) coincidono con le lunghezze d’onda a cui assorbono anche molti altri composti presenti negli alimenti e molti solventi impiegati come fase mobile. Pertanto il rivelatore UV è di scarso impiego nell’analisi dei carboidrati. b) INDICE DI RIFRAZIONE (RID) Nonostante la scarsa sensibilità, l’incompatibilità con l’eluizione a gradiente, le possibili interferenze delle impurezze (se non è stato fatto un buuon clean-up) e la notevole dipendenza della risposta dalla temperatura, pressione e aria disciolta, il RID è ancora utilizzato. c) A LUCE DIFFUSA IN EVAPORAZIONE (ELSD) In considerazione dell’elevata sensibilità, della compatibilità con l’eluzione a gradiente, della risposta lineare molto simile di tutti i carboidrati e della risposta poco influenzata dalla temperatura e dalla velocità di flusso, l’ELSD è attualmente il rivelatore più utilizzato nell’analisi dei carboidrati.

30. IEC = ion exchange chromatography NPC = normal phase chromatography RPC = reverse phase chromatography SEC = size exclusion chromatography PAD = pulsed amperometric detector RID = refractive index detector ELSD = evaporative light-scattering detector

31. ANALISI DEGLI ZUCCHERI DI SUCCO DI MELA 3 1 • oligosaccaridi • saccarosio • glucosio • fruttosio 2 4 0 8 16 24 min COLONNA: 300 mm x 7,8mm, CARBOSep 0,5 mm FASE MOBILE: eluizione isocratica con H2O VELOCITA’ FLUSSO: 0,6 mL/min TEMPERATURA: 90°C DETECTOR: ELSD

32. ANALISI DEGLI ZUCCHERI DI SUCCO DI ARANCIA 2 3 • saccarosio • glucosio • fruttosio • sorbitolo 4 1 0 6 12 min COLONNA: 300 mm x 7,8mm, CARBOSep 0,5 mm FASE MOBILE: eluizione isocratica con H2O VELOCITA’ FLUSO: 0,6 mL/min TEMPERATURA: 85°C DETECTOR: ELSD

33. ANALISI DEI CARBOIDRATI DI CIPOLLA BIANCA • unknown • fruttosio • glucosio • saccarosio • kestosio • nistosio COLONNA: 250 mm x 4,6 mm, HP Carbohydrate 0,4 mm FASE MOBILE: eluizione isocratica con ACN:H2O = 75:25 VELOCITA’ FLUSSO: 1,0 ml/min TEMPERATURA: 40°C DETECTOR: ELSD

34. ANALISI DI ZUCCHERI E POLIOLI (miscela standard) 1 2 3 • raffinosio • saccarosio • lattosio • glucosio • galattosio • fruttosio • ribitolo • mannitolo • sorbitolo 5 4 7 8 6 9 0 10 20 min COLONNA: 300 mm x 7,8 mm, CARBOSep COREGEL-87C 0,5 mm FASE MOBILE: eluizione isocratica con H2O VELOCITA’ FLUSSO: 0,6 mL/min TEMPERATURA: 85°C DETECTOR: ELSD