Методические основы культивирования органов, тканей, клеток и протопластов растений in vitro

1. Методические основы культивирования органов, тканей, клеток и протопластов растений in vitro Помещения: 1. для мытья и стерилизации посуды и инструментов, 2. для приготовления и стерилизации питательных сред, 3. для цитологических исследований, 4. для получения, пассирования и других манипуляций с клеточными культурами, 5. для культивирования клеток растений, 6. боксовая или грунтовая теплица с искусственным освещением.

2. Питательные среды

3. Питательные среды

4. Питательные среды

5. Фитогормоны и регуляторы роста 1.Ауксины: β-индолил-3-уксусная кислота (ИУК); фенилуксусная кислота (ФУК); 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4 Д), индолил-3-масляная кислота (ИМК), α-нафтил-1-уксусная кислота (НУК), фенилуксусная кислота (ФУК), 2,4,5 трихлорфеноксиуксусная кислота (2,4,5Т), п-хлорфеноксиуксусную кислоту (ПХФК), пиклорам (4-амино3,5,6трихлорпиколиновая кислота)

6. Фитогормоны и регуляторы роста Цитокинины: - зеатин [6-(4гидрокси-3метилтранс-2-бутаниламинопурин] , - 6γγ изопентиламинопурин (2iР, ИПА), - кинетин (N6-фурфуриламинопурин), - 6-бензиламинопурин (6-бензиладенин, 6-БАП). Гиббереллины: - гибберелловая кислота GA3 (ГК-3). Ретарданты: - хлорхолинхлорид (ССС), - алар

7. Культура клеток растений может быть получена и успешно поддерживаться только при условии соблюдения асептики. Это достигается благодаря использованию различных методов стерилизации помещений, лабораторной посуды, инструмента, питательных сред. Особо тщательно стерилизуют поверхность эксплантатов, предназначенных для получения культуры клеток. Все работы, при которых открывают культуральные сосуды (разлив стерильной питательной среды по пробиркам, чашкам Петри, колбам, вычленение эксплантатов и их перенос на питательную среду, перенос части культуры на свежую питательную среду и др.) проводят в стерильных условиях в рабочем пространстве ламинар-бокса с соблюдением правил асептики.

8. Основные виды культуры клеток растений: каллюсная, суспензионная, культура протопластов. Базовые принципы культуры клеток, тканей и протопластов растений in vitro

9. Дедифференцировка как условие перехода специализированной клетки к делению и образованию каллюсной ткани. Гормоны – индукторы дедифференцировки Клетки формирующегося зародыша растений являются недифференцированными. Они интенсивно делятся и могут давать начало различным тканям и органам растения. В процессе дифференциации клетки становятся специализированными; при этом они теряют способность к делению. Лишь клетки меристем сохраняются в эмбриональном состоянии. Существует два основных типа меристем - верхушечные (апикальные) и боковые (латеральные). Апикальные меристемы располагаются на верхушках побегов и корней. Они обеспечивают их рост в длину. Такой рост получил название первичного, а сами меристемы – первичных.

10. Дедифференцировка как условие перехода специализированной клетки к делению и образованию каллюсной ткани. Гормоны – индукторы дедифференцировки У растения могут возникать и новые, вторичные меристемы. Это происходит, например, при поранении. Раневые меристемы дают начало каллюсу – особой ткани, состоящей их однородных паренхимных клеток, которые, интенсивно делясь, покрывают место поранения. В процессе их вторичной дифференцировки происходит восстановление поврежденных тканей и органов.

11. Дедифференцировка как условие перехода специализированной клетки к делению и образованию каллюсной ткани. Гормоны – индукторы дедифференцировки Cпособностью к каллюсообразованию обладают клетки специализированных органов (листа, стебля, корня, семядолей) и тканей (меристемных, покровных, проводящих, основных, выделительных, механических) растения. Начальным условием в этом процессе является дедифференцировка: утрата специализации клеток ткани и восстановление их способности к делению. То есть, при каллюсообразовании специализированные клетки как бы возвращаются в меристематическое состояние.

12. Установлено, что дедифференцировка клеток и образование каллюса происходит под воздействием определенных фитогормонов. Процесс дедифференциации специализированных клеток индуцируют ауксины. Однако для того, чтобы дедифференцированные клетки начали делиться, необходимы цитокинины. Если фрагмент специализированных тканей растения (эксплантат) поместить на питательную среду, содержащую фитогормоны, необходимые для образования каллюса, то можно получить культуру каллюсных клеток in vitro - основной тип культуры клеток растений.

13. Каллюсная культура картофеля

14. Дедифференцировка как условие перехода специализированной клетки к делению и образованию каллюсной ткани. Гормоны – индукторы дедифференцировки Если дедифференцировка специализированных клеток обуславливается индукцией деления под влиянием фитогормонов, то дедифференцировка делящихся меристематических клеток связана с остановкой делений, их деспециализацией и только после этого – с индукцией делений, приводящей к каллюсообразованию.

15. Цитоморфологические, физиолого-биохимические особенности каллюсных культур Переход клетки invitroиз дифференцированного состояние к дедифференцировке и активным клеточным делениям обусловлен изменением активности генов. В процессе дедифференцировки в каллюсных клетках появляются специфические белки и одновременно исчезают другие, характерные для клеток эксплантата. Клетки эксплантатов теряют запасенные липиды, крахмал, белки. Фотосинтезирующие клетки утрачивают хлорофилл и липиды хлоропластов. При этом возрастает количество амилопластов, разрушается аппарат Гольджи, перестраивается эндоплазматический ретикулюм и элементы цитоскелета.

16. Цитоморфологические, физиолого-биохимические особенности каллюсных культур Энергетический метаболизм каллюсных клеток в значительной мере напоминает таковой у клеток меристемы. Митохондрии у них слабо развиты, в них мало крист, что оказывает негативное влияние на активность аэробного дыхания. Они потребляют меньше кислорода по сравнению со специализированными клетками растения. У них происходит сдвиг соотношения между дыханием и брожением в сторону брожения. Имеет место повышенное потребление углеводов из-за аэробного гликолиза, сдвиг в обмене углеводов в направлении пентозофосфатного пути, который является источником пентоз, необходимых для делящихся клеток.

17. Цитоморфологические, физиолого-биохимические особенности каллюсных культур Вместе с тем, каллюсные клетки in vitro могут сохранять некоторые физиолого-биохимические особенности растения, с которого был взят эксплантат. Каллюсные культуры теплолюбивых растений лучше растут при более высоких температурах, чем культуры растений умеренного климата. Каллюсные клетки при определенных условиях сохраняют способность синтезировать вторичные метаболиты, характерные для растений-доноров эксплантатов (например, панаксазиды женьшеня). Каллюсным клеткам свойственна устойчивость к токсинам, гербицидам, антибиотикам, засолению, морозо- и жаростойкость и другие свойства, если они имели место у интактных растений.

18. Гетерогенностькаллюсной ткани. Генетические и эпигенетические изменения клеток в культуре invitro В отличие от меристемных клеток, для которых характерны высокая однородность и генетическая стабильность, рост каллюсных клеток, их вторичная дифференцировка происходят неорганизованно и асинхронно. Каллюсная ткань может содержать паренхимные клетки, меристематические, некротические, а также элементы проводящей системы. В каллюсной ткани одновременно присутствуют клетки, находящиеся на разных стадиях митотического цикла. Клеточный цикл у них более длительный, чем у клеток меристемы.

19. Гетерогенностькаллюсной ткани. Генетические и эпигенетические изменения клеток в культуре invitro Культура каллюсных тканей обладает гетерогенностью по цитогенетическим характеристикам. В каллюсной культуре присутствуют клетки разной плоидности. В процессе культивирования доля полиплоидных клеток, как правило, увеличивается. Для культуры каллюсных клеток характерна высокая частота нарушений митоза, что приводит к появлению у них многочисленных хромосомных аберраций. В результате специальных генетических исследований было показано, что в процессе культивирования каллюсных клеток с относительно высокой частотой возникают разнообразные точковые мутации.

20. Гетерогенностькаллюсной ткани. Генетические и эпигенетические изменения клеток в культуре invitro Многие из перечисленных генетических изменений могут быть «перенесены» на организменный уровень путем получения из генетически измененных клеток растений-регенерантов. Явление генетической изменчивости растений-регенерантов, полученных в культуре клеток in vitro (не только из каллюсных культур, но и клеточных суспензий, культуры протопластов) получило название сомаклональной изменчивости.

21. Явление “привыкания” (гормононезависимость) При длительном культивировании могут появляться клеточные клоны, способные расти на среде без регуляторов роста. Это явление получило название «привыкания». Ткани, образованные «привыкшими» клетками (автономными по отношению к экзогенным ауксинам и цитокининам), называются гормононезависимыми. Свойством гормононезависимости в культуре in vitro обладают и растительные опухоли естественного происхождения. Наиболее изученными из них являются корончатые галлы - опухоли, индуцированные у двудольный растений агробактериями

22. Суспензионная культура клеток растений Для получения клеточной суспензии каллюсную ткань помещают в сосуд с жидкой питательной средой (приблизительно 2 г ткани на 100 мл среды). Предпочтительно использовать рыхлые каллюсы, которые легко распадаются на кластеры и небольшие агрегаты клеток. Суспензия перемешивается на качалке со скоростью 100-120 об/мин.

23. Суспензионная культура клеток растений Примерно через две недели суспензию фракционируют на одиночные клетки, мелкие кластеры и большие агрегаты каллюсных клеток. Проще всего это сделать с помощью отстаивания суспензии в течение 1-2 минут. Крупные агрегаты оседают на дно, а одиночные клетки и мелкие агрегаты клеток остаются в поверхностной фазе. Чтобы удалить из суспензии крупные агрегаты клеток также используют фильтрование через 1-2 слоя марли, нейлоновые сита. Улучшить дезагрегациюкаллюсных клеток при получении суспензионной культуры клеток можно, предварительно выращивая каллюс на питательной среде без ионов кальция, содержащей в качестве ауксина 2,4 Д. Хороший эффект дает добавление в среду ферментов пектиназы (около 2 мг/л) и целлюлазы (0,01 мг/л).

24. Суспензионная культура клеток растений Как и каллюсные культуры, суспензию клеток периодически переносят на свежую питательную среду (пассируют). Для этого суспензию фильтруют через нейлоновое сито и часть объема культуры, содержащего одиночные клетки или мелкие агрегаты - инокулят (inoculum), переносят в стерильных условиях в приготовленную питательную среду. Каждая линия культуры клеток растений характеризуется минимальным объемом инокулята, меньше которого культура не возобновляет рост (чем он меньше, тем лучше линия).

25. Суспензионная культура клеток растений Рост клеток в суспензионных культурах клеток оценивают по одному или нескольким из следующих параметров. - Объем осажденных клеток (ООК). ООК – величина, равная отношению объема осадка к объему суспензии, выраженное в %. - Число клеток в единице объема питательной среды: подсчитывается в камере Фукса-Розенталя. - Сырая и сухая масса. - Содержание белка. - Проводимость среды; ее определяют с помощью кондуктометра – она обратно пропорциональна массе клеток. - Жизнеспособность клеток. Ее оценивают, изучая движение цитоплазмы под микроскопом, а также с помощью окраски 0,5 % раствором синего Эванса или 0,01% раствором флюоресцеиндиацетата: живые клетки не окрашиваются красителями вследствие непроницаемости для них клеточных мембран.

26. Фазы кривой роста ККР I – лаг-фаза; II – экспоненциальная фаза; III – фаза линейного роста; IV – фаза замедленного роста; V – стационарная фаза; VI – фаза отмирания

27. Культура протопластов растений Изолированный протопласт – это часть клетки, которая остается после удаления клеточной стенки. Для удаления клеточной стенки в настоящее время используют целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы, получаемые из грибов – Myrothecium, Aspergillus, Trichoderma и других, из пищеварительного сока улитки Helixpomatia.

28. Культура протопластов растений Протопласты выделяют из разных тканей растений, а также из клеток каллюсных и суспензионных культур. С целью получения большого числа однотипных протопластов у двудольных используют мезофилл молодых листьев. Наиболее освоены методы изоляции и культивирования протопластов у представителей семейства Solanaceaeи отдельных видов Brassica. Трудными объектами для получения протопластов, способных к реализации тотипотентности, являются однодольные растения, в том числе злаки, а также хвойные.

29. Культура протопластов растений Выживание клетки, лишенной клеточной стенки, возможно лишь при создании оптимума осмотических свойств среды выделения и культивирования протопластов. Для этого клетки и выделенные протопласты поддерживают в плазмолизированном состоянии путем внесения 0,3÷0,8 моль/л осмотических стабилизаторов: сахаров (маннита, глюкозы, сорбита, ксилозы), ионных осмотиков (CaCl2, KCl)

30. Культура протопластов из мезофилла листа табака

31. Методика выделения протопластов из паренхимы листа 1. После стерилизации у листьев удаляют нижний эпидермис, крупные жилки и нарезают полосками шириной около 5 мм. Нарезанные фрагменты листьев помещают в чашки Петри в смесь ферментов пектиназы и целлюлазы. Например, для листьев табака используют смесь 0,5 % пектиназы, 2% целлюлазы и 13% сорбитола, рН = 5,4. 2. Инкубируют фрагменты листьев в ферментной смеси в термостате 15-18 часов при 25°С. 3. Отмывание протопластов от ферментов производится путем трехкратного центрифугирования при 170 g по 2 мин. 4. Отмытые протопласты ресуспендируют в культуральной среде, содержащей 13% маннитола, до концентрации 4×105 протопластов в 1 мл. Плотность протопластов должна быть оптимальной для каждой культуры. Суспензию протопластов переносят в чашки Петри с жидкой или агаризованной средой или культивируют методом микрокапель

32. Культура протопластов растений Сразу после того, как суспензия протопластов отмыта от раствора ферментов, протопласты начинают регенерировать клеточную стенку. Уже через 2-4 дня после выделения протопласты утрачивают сферическую форму, что означает полное восстановление клеточной стенки. В зависимости от объекта и условий культивирования к последующему делению может приступить от 0,1 до 80 % восстановивших клеточную стенку протопластов. Первые деления могут происходить через 2-10 дней с начала культивирования протопластов. Образовавшиеся клеточные колонии после переноса на среду для регенерации могут дать начало растениям-регенерантам как обычные каллюсные культуры.

33. Культура одиночных клеток и протопластов. Получение колоний из клеточных суспензий Методика «плэйтинга» (высева) (Bergmann, 1960). В качестве исходного материала используют хорошо растущую суспензию клеток растений в концентрации в два раза большей, чем предполагается получить при высеве на агаризованную питательную среду. Предварительно суспензию фильтруют через нейлоновый фильтр, чтобы в ней остались единичные клетки или мелкие клеточные агрегаты. Готовят 0,6–1% агаровую среду того же состава, который был использован для поддержания роста суспензии, нагревают среду для растворения агара и после ее охлаждения до 35оС перемешивают с равным количеством клеточной суспензии. Смесь разливают в чашки Петри слоем около 1 мм, чашки заклеивают парафильмом. С помощью инвертированного микроскопа определяют местоположение отдельных клеток, которое отмечают маркером на крышках чашек. Проводят культивирование в термостате, периодически наблюдая под микроскопом деление клеток, используя сделанные метки.

34. Культура одиночных клеток и протопластов. Получение колоний из клеточных суспензий Для успешного деления клеток растений в суспензии или при высеве на агаризованную питательную среду важное значение имеет фактор кондиционирования. Для кондиционирования питательной среды при культивировании одиночных клеток применяют: Добавление в среду для культуры клеток питательной среды от интенсивно растущей клеточной суспензии в фазу экспоненциального роста (после фильтрации через мелкий фильтр). «Кормящий слой» - агаризованный слой-подложку облученных клеток, утративших способность к делениям, но способных поддерживать рост других клеток (Raveh, Galun, 1975). Метод культуры-«няньки»: на поверхность интенсивно растущего каллюса помещают фильтровальную бумагу, на которую наносят суспензию (Muir et al., 1954).

35. Культура одиночных клеток и протопластов. Получение колоний из клеточных суспензий Обогащенная питательная среда 8р Као и Михайлюка (Kao, Michаyluk, 1975) давала хорошие результаты при культивировании разведенных суспензий протопластов бобов и сои Caboche (1980) показал, что если мезофильные протопласты табака в течение первых нескольких дней культивировать на питательной среде, содержащей высокие концентрации ауксина, а затем перенести на среду с пониженным его содержанием, то клетки оказывались способны к делениям даже при плотности высева 1-2 клетки/мл.

36. Культура одиночных клеток и протопластов. Получение колоний из клеточных суспензий Уменьшении объема питательной среды при культивировании единичных клеток позволяет сделать отношение объема клетки к объему питательной среды таким же, как и в обычных культурах при небольшом разведении. Для этого используются специальные приспособления. Jones et al. (1960) предложили для культивирования одиночных клеток метод микрокамеры. Ю.Ю. Глеба (1978) разработал метод культивирования протопластов в микрокаплях питательной среды объемом до 1 мкл.

37. Тотипотентность растительных клеток Способность отдельных клеток растений менять программу развития, претерпевать дедифференцировку, вторичную дифференцировку и, в результате, давать начало целому растению, то есть реализовать заключенную в них генетическую информацию, получило название тотипотентности (от латинских слов ″totus″ - весь, целый и ″potentia″ - сила).

38. Вторичная цитодифференцировка: гистогенез, органогенез, эмбриогенез Развитие клетки специализированной ткани после ее дедифференцировки в каллюсную может проходить в следующих направлениях. - Клетка претерпевает вторичную дифференцировку и прекращает делиться, то есть превращается в дифференцированную каллюсную клетку. Это нормальный цикл развития каллюсной клетки, заканчивающийся ее старением и отмиранием. - Стойкая дедифференцировкакаллюсной клетки, приобретение ею способности расти на среде без гормонов, т.е. превращение в опухолевую (свойственно некоторым клеткам старых пересадочных культур); - Вторичная дифференцировка, сопровождающаяся гистогенезом (образованием в каллюсе различных тканей) или морфогенезом (возникновением организованных структур).

39. Вторичная цитодифференцировка: гистогенез, органогенез, эмбриогенез Морфогенез проходит в виде органогенеза или соматического эмбриогенеза. Органогенез – это регенерация в культуре клеток in vitro отдельных органов растения: стеблей, корней, реже - флоральных элементов, зачатков листьев. Соматический эмбриогенез – образование эмбриоидов, то есть структур, напоминающих зиготические зародыши. Как органогенез, так и соматический эмбриогенез могут иметь место не только в культуре клеток (каллюсной или суспензионной культуре), но и в растениях in vivo (пример – адвентивная полиэмбриония у цитрусовых), а также в культуре in vitro непосредственно из эксплантата (прямой морфогенез).

40. Вторичная цитодифференцировка: гистогенез, органогенез, эмбриогенез В результате стеблевого органогенеза образуется однополярная структура, содержащая апикальную меристему стебля. При этом формирующийся стебель сохраняет контакт с помощью сосудистой системы с материнской тканью. Образовавшиеся в культуре клеток проростки можно укоренить (in vitro или in vivo) и получить, таким образом, целое растение. В результате соматического эмбриогенеза формируется двуполярная структура (эмбриоид), которая содержит как стеблевую, так и корневую меристему. Эмбриоиды не имеют сосудистого сообщения с материнскими тканями. В культуре in vitro при определенных условиях эмбриоиды также способны развиться в растение.

41. Вторичная цитодифференцировка: гистогенез, органогенез, эмбриогенез Факторы, оказывающие влияние на способность к морфогенезу: Растения двудольные или однодольные Вид растений, генотип в пределах вида Возраст растения, его физиологическое состояние Условия выращивания, время года Эксплантат, его размер Состав питательной среды, прежде всего состав и соотношение фитогормонов, ее консистенция Условия культивирования

42. Индукция морфогенеза. Гормоны – индукторы морфогенеза Под влиянием того или иного стимула морфогенеза каллюсная клетка становится детерминированной, то есть определившей путь, по которому будет проходить ее развитие. Лишь одна из 400—1000 становится на путь вторичной дифференцировки, приводящей к морфогенезу. Способность воспринимать индуцирующее воздействие и специфически реагировать на него изменением программы развития называют компетентностью клетки.

43. Индукция морфогенеза. Гормоны – индукторы морфогенеза Наиболее мощным индуктором органогенеза, который принято называть стимулом или сигналом морфогенеза, является изменение соотношения между концентрациями цитокининов и ауксинов, входящими в состав питательных сред. Skoog, Miller (1957) показали, что при культивировании каллюса, полученного из паренхимы стебля табака на питательной среде, содержащей ауксин (ИУК) и цитокинин (кинетин) приблизительно в равных молярных концентрациях имеет место интенсивная пролиферация клеток, при преобладании цитокининов над ауксинами часто начинается стеблевой органогенез, а в случае преобладания ауксинов – корневой.

44. Стеблевой и корневой органогенез в культуре клеток табака в зависимости от соотношения концентраций ауксинов и цитокининов в питательной среде (по Скуг, Миллер, 1957)

45. Индукция морфогенеза. Гормоны – индукторы морфогенеза Органогенез в каллюсной ткани начинается с того, что под влиянием соответствующих воздействий компетентная клетка или группа компетентных клеток обособляются от окружающих их каллюсных клеток, образуя зоны повышенной митотической активности – так называемые меристемоиды («инициаль») [Torrey, 1966]. Меристемоиды обычно располагаются в нижней части каллюса, вблизи трахееподобных элементов, что обеспечивает контакт с питательной средой и восприятие гормонального стимула. Клетки меристемоидов отличаются от остальных каллюсных клеток небольшими размерами, имеют изодиаметрическую форму, тонкие стенки, многочисленные мелкие вакуоли. Крупное ядро обычно занимает центральное положение.

46. Индукция морфогенеза. Гормоны – индукторы морфогенеза В дальнейшем в меристематическом очаге дифференцируются зачатки стебля, корня, листа или цветочной почки и, соответственно, происходит стеблевой, корневой, листовой или флоральный органогенез. Формированию меристемоидов предшествует аккумуляция крахмала в зонах их расположения. Сам процесс органогенеза характеризуется значительными затратами энергии (усиление гликолиза и пентозофосфатного пути окисления углеводов). Показано, что морфогенез в культуре каллусных тканей табака характеризуется включением и выключением синтеза определенных белков-маркеров. Индуцированная детерминация клеток каллюсной ткани сопряжена с появлением в ней антигена-маркера клеток меристемы стебля.

47. Индукция морфогенеза. Гормоны – индукторы морфогенеза Для индукции соматического эмбриогенеза необходимо присутствие в питательной среде ауксина. Считается, что ауксин, а также другие индукторы эмбриогенеза (например, электрическое поле), изменяют полярность компетентных клеток, что приводит к появлению градиентов эндогенного ауксина, биоэлектрических потенциалов и кальция. Кроме того в клетках происходит перестройка элементов цитоскелета, которая связана с их поляризацией и последующими ассиметричными делениями. Именно мелкие дочерние клетки, образовавшиеся в результате ассиметричного деления являются эмбриогенными (детерминированными к эмбриогенезу). Предетерминированныеэмбриогенные клетки могут также изначально присутствовать в тканях эксплантата

48. Индукция морфогенеза. Гормоны – индукторы морфогенеза Эмбриогенные клетки отличаются от остальных каллюсных клеток малыми размерами, угловатой формой, более плотной цитоплазмой, мелкими вакуолями (около 30% объема клетки), множеством крахмальных зерен. Они имеют крупное ядро и большое количество рибосом. Микротрубочки у них имеют линейную ориентацию параллельно оси клетки. Между эмбриогенными клетками восстанавливаются плазмадесмы, которые практически отсутствуют в массе каллюсных клеток.

49. Индукция морфогенеза. Гормоны – индукторы морфогенеза В результате деления эмбриогенных клеток формируется так называемый глобулярный проэмбрио. Условием его дальнейшего развития является перенос культур на питательную среду, содержащую пониженные концентрации ауксинов, или на полностью безгормональную среду. Устранение из питательной среды дедифференцирующего фактора (ауксина) приводит к тому, что проэмбрио превращается в глобулярный зародыш, который далее проходит стадии, характерные для развития зиготических зародышей: «сердечко», «торпедо», зрелый соматический эмбриоид. Соматические эмбриоиды имеют как стеблевые, так и корневые меристемы.

50. Регенерация растений из каллюсной культуры