Avaliação do repertório TCR

1. Avaliação do repertório TCR Prof.Doutor José Cabeda

2. Regiões V Limitado na variabilidade Passível de estudo por citometria CDR1 e CDR2 Variabilidade limitada à região V CDR3 O mais variável Contribuição de V,D e J Variabilidade Sequência Tamanho Escolha das regiões génicas a estudar Prof. Doutor José Cabeda

3. CD4 / CD8 Variabilidade de uma pode obscurecer alterações na outra Repertório muito diferente Local em estudo Sangue periférico Tecidos infectado/tumor Nódulos linfáticos Purificar as células a estudar Prof. Doutor José Cabeda

4. Selecção da Técnica Prof. Doutor José Cabeda

5. Southern Blot Prof. Doutor José Cabeda

6. Prof. Doutor José Cabeda

7. Multiplex PCR for CDR3 length Prof. Doutor José Cabeda

8. Electroforese Capilar (II) • Fluxo Electro-osmótico (FEO): • A superfície do capilar de vidro-silica contém grupos funcionais carregados negativamente, os quais atraem iões carregados positivamente. Estes iões migram para o pólo negativo, carregando consigo moléculas do solvente. • Moléculas neutras viajam á velocidade do FEO • Moléculas positivas são mais rápidas que o FEO • Moléculas negativas são mais lentas que o FEO • todas as moléculas migram para o pólo negativo (com velocidade que depende da sua carga e do seu peso molecular), onde podem ser detectadas com o mesmo tipo de aparelhagem utilizado em HPLC. Prof. Doutor José Cabeda

9. Electroforese capilar (III) Prof. Doutor José Cabeda

10. Prof. Doutor José Cabeda

11. Métodos baseados na conformação • Conformação do dsDNA • não depende da sequência • A conformação de homodupletos é diferente da dos heterodupletos • A conformação dos heterodupletos depende da sequencia de “mismatch” • Conformação do ssDNA • depende da sequência (forma zonas de dupleto intramolécular, dependentes da sequência) Prof. Doutor José Cabeda

12. dsDNA é desnaturado dsDNA é diluido Renaturação rápida Corrida em condições semi-desnaturantes e a temperaturas fixas Resultado depende muito de: Temperatura de corrida Concentração de desnaturante Presença de certos químicos (ex: glicerol, etc) Single Strand Conformation Polimorfism (SSCP) WT1 mutantes WT2 Prof. Doutor José Cabeda

13. Heteroduplex Analysis (HA) • Heterodupletos causam • Distorção na conformação • Migração no gel mais lenta • Heterodupletos podem existir por: • Co-amplificação por PCR de heterozigotos • Introdução de DNA WT e M no mesmo PCR • Correm-se no mesmo gel amostras WT, M e WT+M Prof. Doutor José Cabeda

14. Heteroduplex Analysis (HA) • Sensibilidade entre 80-90% (fragmentos <300bp) • Utilização do análogo de acrilamida (MDE ou DEM) aumenta a sensibilidade da HA • A adição de ureia ao gel pode criar um ambiente semi-desnaturante que aumenta a resolução do HA Prof. Doutor José Cabeda

15. Citometria de Fluxo Prof. Doutor José Cabeda

16. Análise de activação celular Prof.Doutor José Cabeda

17. Prof. Doutor José Cabeda

18. Prof. Doutor José Cabeda

19. CD2 “crosslinking” aCD2-biot + avidina Colher sangue Incubar c/ aCD2/2R-avidina 4h-37ºC Lavar Marcar c/ CD4/CD69/CD3 CD8/CD69/CD3 Lavar Fixar Analisar em citómetro Medida da função precoce de receptores: ensaio de activação CD69 Prof. Doutor José Cabeda

20. Titular no tempo o efeito do activador Prof. Doutor José Cabeda

21. Medida da expressão de receptores pós activação: ensaio quantitativo • Muitas moléculas variam de expressão no decorrer da activação • CD95(fas)CD38,CD26, CD25, receptores de quimoquinas (CXCR4, CCR3, CCR5) • Colher sangue • Marcar células • Correr no citómetro juntamente com painel beads p/ calibração da Intensidade de fluorescência Prof. Doutor José Cabeda

22. Medida da activação celular: concentração intracelular de Ca2+ • Colher sangue • Separar cel.mononucleares • cultivar em meio de cultura c/ PHA 3 dias em 5%CO2 • Cultivar 4 dias em meio c/ IL2 • Adicionar INDO-1 • Incubar 40 min-31ºC • Lavar • Incubar 5min-37ºC • Ler no citometro 30 seg. • Interromper p/ Activar • Ler no citometro Prof. Doutor José Cabeda

23. Análise de Função celular 2 – Função das células fagociticas Prof.Doutor José Cabeda

24. Definir a população de monócitos • FSC/SSC • SSC/CD14 • SSC/CD16 • HLA-DR pode também ajudar: • Monocitos HLA-DR+ • Granulócitos HLA-DR- Prof. Doutor José Cabeda

25. Definir a população de granulócitos • FSC/SSC • SSC/CD33 Prof. Doutor José Cabeda

26. Avaliação do aumento de expressão de integrinas b2 • Integrinas b2 • CD11a (LFA1) expresso em todos os leucócitos • CD11b,CD11c expressos em monocitos, granulócitos e Nk • Partilham a cadeia b (CD18) • Mutações em CD18 originam LAD1 (leucocyte adesion deficiency type 1) • Estimular PBMC c/ PMA 15’-37ºC • Preparar 1 tubo sem estimulação • Marcar c/ CD11b • Preparar tb um control IgG2a • Fixar • Analisar em citómetro Prof. Doutor José Cabeda

27. Estudo de expressão de FcReceptor • 3 FcReceptors: • CD16 • CD32 • CD64 • CD64 aumenta rápidamente em monócitos e granulócitos em resposta a IFN-g, GCSF (não GMCSF) e IL12 • Marcação standard com a-CD64 utilizando beads standard para intensidade de fluorescência para a quantificação • Útil para • Confirmação de um processo inflamatório agudo • Monitorizar e ajustar a dose em doentes a receber IFN-g Prof. Doutor José Cabeda

28. Estudo de quimiotaxia • Estudo é possível, mas não é frequente no laboratório de análises clinicas Prof. Doutor José Cabeda

29. Estudo de fagocitose • Colher sangue em heparina (citrato e EDTA reduzem fagocitose) • Arrefecer o sangue em gelo-15min • Misturar c/ E.coli marcadas c/ FITC e opsinizadas c/Ig e complemento (pool de soro) • Incubar 1 tubo a 37ºC e outro em gelo (control neg.) • Colocar em gelo • Adicionar sol quenching fria para impedir a fluorescência devida a bactérias não internalizadas, mas ligadas à membrana no fagocito • Lavar • Adicionar sol.lise (lise de eritrócitos e fixação dos leucócitos) • Analisar em citómetro em 30 min. • Adicionalmente pode-se marcar vas células c/ a-CD14 e a-CD33 Prof. Doutor José Cabeda

30. Estudo de “Killing” • A morte induzida pelos fagócitos é primáriamente o resultado da geração de radicais de oxigénio activos (RO) • A principal via de geração de RO é a via da NADPH oxidase • Deficiencias genéticas nestas enzimas originam CGD (doença granulomatose crónica). • Na presença de Peroxidases e H2O2, PMN’s normais convenientemente estimulados oxidam o corante DHR-123 a rodamina.123, tornando as células fluorescentes. As células de doentes com CGD não metabolizam o corante. Prof. Doutor José Cabeda

31. Análise de Função celular 3 – Apoptose Prof.Doutor José Cabeda

32. Colher sangue C/ anticoagulante • Manter o sangue sempre a RT • Processar de imediato e nunca depois de 6h pós-colheita • Preparar PBMC Prof. Doutor José Cabeda

33. Detecção de células c/ menor conteúdo de DNA (subdiplóides) • Activação de endonucleases origina a degradação de DNA • PI (iodeto de propidium) é um fluorocromo com afinidade para DNA • DNA fica fluorescente • Intensidade de fluorescência é proporcional á quantidade de DNA/célula • lavar cels em HBSS • Ressuspender (106 cells) em ET-OH • Incubar 1 h a 4ºC • Remover sobrenadante (SN) • Adicionar HBSS,RNAse e PI • Incubar 15 min a RT • Manter a 4ºC no escuro • Ler no citómetro Prof. Doutor José Cabeda

34. Detecção de células subdiplóides (Ex.) Prof. Doutor José Cabeda

35. Detecção de células c/ quebras no DNA (Método TUNEL) • Introdução de dUTP-FITC nas quebras do DNA pela TdT • Incubar c/ permeafix 40’-RT • Lavar • Ressuspender na sol. Marcação contendo TdT, tampão, dUTP-FITC • Incubar 1h-37ºC • Lavar • Ler no citometro Prof. Doutor José Cabeda

36. Método TUNEL (Ex.) Prof. Doutor José Cabeda

37. Detecção de células c/ fosfatidilserina translocada Método da anexina V • A fosfatidilserina encontra-se habitualmente apenas no folheto interno da membrana • Em células apoptóticas a assimetria membranar perde-se expondo fosfatidilserina • A Anexina V é capaz de se ligar à fosfatidilserina Prof. Doutor José Cabeda

38. Método da anexina V (Ex.) Prof. Doutor José Cabeda

39. Estudos de citocinas Prof.Doutor José Cabeda

40. Estudos de citocinas • Em condições normais não são detectáveis citoquinas nos fluidos biológicos • A presença de citoquinas nos fluidos biológicos é caracteristica • de situações patológicas • De estadios de situações patológicas • As citoquinas podem ser estudadas por: • Imunoensaios (ELISA, RIA) • Bioensaios • Citometria • Métodos moleculares Prof. Doutor José Cabeda

41. Detecção de citoquinas: ELISA Prof. Doutor José Cabeda

42. Bioensaios • Uso de uma linha celular que responde à presença de uma citocina • Cultura da linha celular na presença e na ausência de fluido a testar, e na presença da citocina recombinante. • A medida da actividade celular é indicadora da presença/ausência de citocina • Tipos de bioensaios (actividade celular medida) • Actividade citotoxica • Proliferação • Função celular específica • Quantidade de uma proteína induzida Prof. Doutor José Cabeda

43. Activation of M in vitro Test for effect on other cells Cytokine secretion +/- Detecção de citoquinas:Bioensaios Remove cytokine containing supernatant Which cytokine? Prof. Doutor José Cabeda

44. Test for a characteristic effect on other cells e.g. interleukin-1 Induces proliferation in thymocytes Include an antibody that blocks interleukin-1 + IL-1 absent + - IL-1 present Especificidade dos bioensaios Prof. Doutor José Cabeda

45. Citometria de fluxo • Estimular as células • Mitogénio • Ag+coestimuladores (a-CD28+ a-CD49d) • Bloquear a secreção de citoquinas (brefeldin –BfA ou monensin) • Lisar os eritrócitos e fixar • Permeabilizar as células • Marcar com anticorpo • Analisar Prof. Doutor José Cabeda

46. Detecção de IFN-g por citometria Prof. Doutor José Cabeda

47. Ensaios Moleculares Prof. Doutor José Cabeda