1 / 35

2 rodzaje cytometrów przepływowych: analizator sorter

Zasady analizy FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting, cytometria przepływowa, cytofluorymetria). Cytometria – metoda pomiaru właściwości fizycznych i chemicznych pojedynczych komórek lub obiektów biologicznych (jądra komórkowe, mitochondria, chloroplasty). 2 rodzaje cytometrów przepływowych:

zeki
Download Presentation

2 rodzaje cytometrów przepływowych: analizator sorter

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. Zasady analizy FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting, cytometria przepływowa, cytofluorymetria) Cytometria – metoda pomiaru właściwości fizycznych i chemicznych pojedynczych komórek lub obiektów biologicznych (jądra komórkowe, mitochondria, chloroplasty) • 2 rodzaje cytometrów przepływowych: • analizator • sorter

  2. Historia: 1934 – publikacja opisująca metodę liczenia komórek przepływających w kapilarze (czujnik fotoelektryczny) 1947 – pierwsze doniesienie o cytofluorymetrycznej detekcji bakterii w aerozolach (badania sponsorowane przez armię USA) urządzenie: detekcja w komorze przepływu w ciemnym polu – oświetlenie światłem widzialnym – detekcja cząstek o średnicy 0.6um 1953 – Wallace Coulter patentuje urządzenie do liczenia krwinek w strumieniu cieczy (wykorzystuje czujnik fotoelektryczny i zasadę ogniskowania hydrodynamicznego)

  3. Budowa cytometru

  4. Część hydrauliczna • transportuje obiekty w strumieniu cieczy do komory pomiarowej • zapewnia oddzielny przepływ pojedynczych obiektów • ogniskuje przepływające obiekty w środku wiązki lasera

  5. Część hydrauliczna (ogniskowanie hydrodynamiczne) zawiesina próbki • zawiesina obiektów jest wtłaczana w otoczce płynu osłaniającego do dyszy • płyn osłaniający płynie szybciej od centralnego strumienia próbki • przepływ laminarny centralnego strumienia (o średnicy ok. 30um) umożliwia przepływ pojedynczych obiektów przed optoelektronicznymi układami rejestrującymi płyn osłaniający

  6. Część hydrauliczna • szybkość przepływu 12 – 300 ul/min. • szybkość akwizycji 300 – 50 000 komórek/s • szybkość akwizycji zależy od gęstości obiektów !

  7. Układ optyczny

  8. Fluorescencja w układzie optycznym Emisja fotonu następuje wtedy, kiedy elektron powraca z wyższej (stan wzbudzenia) orbity na niższą (stan spoczynku)

  9. Fluorescencja w układzie optycznym • Prawo Stokes’a • długość fali emisyjnego promieniowania fluorescencyjnegojest zawsze większa od długości fali promieniowaniawzbudzającego fluorescencję • Przesunięcie Stokes’a • - różnica energii pomiędzy pikiem absorpcji a pikiem emisji Stokes Shift is 25 nm Cząsteczka fluoresceiny 520 nm 495 nm Intensywność fluorescencji Długość fali

  10. Rodzaje stosowanych fluorochromów • autofluorescencjaNADPH, chlorofil, melanina, kolagen, tyrozyna, tryptofan • białka wykazujące fluorescencję • GFP i jego odmiany: EGFP, ECFP, EYFP • DsRed • 3. aromatyczne związki organiczne • fluoresceina, rodamina, Cy3, DAPI, Alexa Fluor • 4. kropki kwantowe http://www.microscopyu.com

  11. Budowa kropek kwantowych • rdzeń – selenid kadmu lub telurid kadmu • powłoka siarczkowo-cynkowa • powłoka polimerowa (umożliwia uzyskanie rozpuszczalności w wodzie, pozwala na koniugowanie nanokryształu z p.ciałem, nukleotydem, streptawidyną; PEG pełni funkcję łącznika) • cząsteczka biologiczna Molecular Probes

  12. Właściwości kropek kwantowych: • rozmiar zbliżony do dużego białka • jednakowe spektrum absorpcji • rozmiar kryształu determinuje barwę emisji • silna fluorescencja • ‘wypalanie’ barwnika nieznaczne Molecular Probes

  13. Układ optyczny najczęściej wykorzystywane lasery: argonowy – niebieski (488nm) diodowy – czerwony (635nm) analiza: zielony, żółty, czerwony, daleki czerwony

  14. Układ optyczny rodzaje filtrów górnoprzepustowy dolnoprzepustowy pasmowy

  15. Układ optyczny analizowanie obiektów barwionych kilkoma fluorochromami → spektra emisyjne nakładają się kompensacja – proces polegający na eliminacji nakładających się zakresów emisji

  16. Układ elektroniczny • przetwarza sygnał analogowy na cyfrowy • pomiar wielkości napięcia • przeprowadza kompensację

  17. Wykresy dwuwymiarowe konturowy – zawiera dodatkową informację (3 wymiar) o ilości zdarzeń posiadających określone parametry x-y rozproszenia – 2 parametry jednocześnie, każda oś oznacza intensywność, każda kropka – 1 zdarzenie gęstości – kolor oznacza akumulację określonych zdarzeń

  18. histogram 3-D – oś Z oznacza ilość zdarzeń histogram – pojedynczy parametr a ilość zdarzeń

  19. Określone populacje (spełniające zadane kryteria) obiektów mogą zostać wyselekcjonowane i oddzielone od innych przez bramkowanie zastosowanie w mieszanych populacjach obiektów do analizy określonych parametrów lub w sortowaniu do uzyskania homogennej populacji

  20. Rodzaje danych uzyskiwanych w cytometrii laser detektor przedni FSC (forward scatter) - wielkość detektor boczny SSC (side scatter) - ziarnistość Purdue University Cytometry Laboratories

  21. Detektor rozproszenia pod kątem 90 stopni- granulacja komórek i obecność struktur komórkowych SSC Detektor rozproszenia na wprost – informacja o wielkości komórki lub cząsteczki badanej Laser FSC • Rozproszenie na wprost • Określa wielkość komórki • Mierzone wzdłuż osi padającego lasera na wprost • Rozproszenie boczne—światło lasaerowe odbite i rozproszone • Określa gęstość i liczbę ziarnistości (względnie) • Mierzona pod kątem 90° w stosunku do wiązki laserowej

  22. Rozproszenie na wprost (FSC) Wielkość Laser mała ~ mały FSC Laser duża ~ wysoki FSC

  23. Zasady analizy FACS – analiza ziarnistości i wielkości NEUTROFILE FSC MONOCYTY 200 400 600 800 1000 0 90 Degree Scatter LIMFOCYTY SSC Purdue University Cytometry Laboratories

  24. Rodzaje danych uzyskiwanych w cytometrii– analiza fluorescencji detektor przedni laser Ilość komórek Fluorescencja detektory fluorescencji (PMT3, PMT4 etc.) Purdue University Cytometry Laboratories

  25. Zasady analizy FACS – analiza fluorescencji żółta fluorescencja zielona fluorescencja Purdue University Cytometry Laboratories

  26. Zasady sortowania metodą FACS • na zasadzie mechanicznego wychwytu wybranej populacji obiektów przez kapilarę poruszającą się ruchem wahadłowym w strumieniu cieczy (‘catcher-tube sorting’) • słaba wydajność (300 komórek/s) • duże rozcieńczenie sortowanych obiektów

  27. Zasady sortowania metodą FACS • sortery kroplowe – wykorzystują drgania kryształu piezoelektrycznego powodującego rozerwanie strumienia cieczy w komorze przepływu na pojedyncze kroplew zależności od posiadanego ładunku na powierzchni obiekty są odchylane w polu elektrycznym (wytwarzanym przez płytki odchylające) do odpowiednich probówek • możliwość sortowania do 4 różnych populacji jednocześnie • szybkość sortowania do 70 000 komórek/s

  28. kryształ piezoelektryczny

  29. Wykorzystanie • ocena subpopulacji limfocytów (niedobory immunologiczne, ocena skuteczności immunosupresji) • oznaczanie antygenów HLA (transplantologia) • oznaczanie antygenów HLA B27 (ocena schorzeń autoimmunologicznych) • ocena stopnia degranulacji bazofilów i poziom limfocytów Th1 i Th2 (alergologia) • identyfikacja mutacji chromosomalnych np. chromosom Filadelfia (cytogenetyka) • sortowanie komórek macierzystych (przeszczepy) • sortowanie gamet męskich z chromosomem X i Y (zapłodnienie pozaustrojowe)

  30. M G2 G0 / G1 G0 G1 Count G2 / M S S 0 200 400 600 800 1000 zawartość DNA 4N 2N Przykład zastosowania Zawartość DNA w komórkach w hodowli asynchronicznej barwienie jodkiem propidyny – PI, pozwala ocenić fazy cyklu komórkowego

  31. HISTOGRAM DNA • pik G0-G1odpowiada • ilości DNA = 2n • w fazie G0i G1 G0-G1 G2-M • obszar S to rozkład • zawartości DNA w • fazie S cyklu • komórkowego ilość komórek S • pik G2-M odpowiada • ilości DNA = 4n • w fazie G2i M intensywność fluorescencji PI

  32. Mikroskopia fluorescencyjna Molecular Biology of the Cell. 4th edition.Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al.New York: Garland Science; 2002.

  33. Mikroskopia fluorescencyjna Molecular Biology of the Cell. 4th edition.Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al.New York: Garland Science; 2002.

  34. Mikroskopia konfokalna Molecular Biology of the Cell. 4th edition.Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al.New York: Garland Science; 2002. http://www.microscopyu.com/tutorials/java/virtual/confocal/index.html

  35. Dekonwolucja w mikroskopii Zaawansowana technika komputerowej obróbki obrazu mikroskopowego (w formie stosów obrazów – tj. przekrojów w różnych płaszczyznach ostrości) pozwalająca na wyeliminowanie zakłóceń pochodzących z innych płaszczyzn optycznych http://www.olympusmicro.com/primer/digitalimaging/deconvolution/deconintro.html http://micro.magnet.fsu.edu/primer/digitalimaging/deconvolution/deconalgorithms.html

More Related