Kinetyka reakcji enzymatycznych

1. Enzymologia-9 Kinetyka reakcji enzymatycznych

2. Metody pomiaru szybkości reakcji enzymatycznych: • reakcje sprzężone Heksokinaza D-Glc + ATP D-Glc-6-P + ADP Dehydrogenaza Glc-6-P D-Glc-6-P D-glukono-d-lakton-6-P NADPH NADP+ • pomiary zmian fluorescencji

3. pomiar szybkości przez zastosowanie związków zawierających izotopy promieniotwórcze Dekarboksylaza ornitynowa -14COOH putrescyna ornityna 14CO2

4. Warunki badania szybkości reakcji: • Substraty i bufory odpowiedniej jakości i czystości • Aktywny preparat enzymatyczny • Enzym powinien być stabilny w warunkach prowadzenia pomiarów • Optymalna temperatura oraz pH prowadzenia reakcji • Odpowiednia metoda zatrzymywania reakcji enzymatycznej: • - temperatura 100°C • - 1% roztwór SDS • - w przypadku metaloenzymów dodatek EDTA • - dodanie silnego kwasu np.: trichlorooctowego (2-3%) • Podczas oznaczenia zapewnione warunki stanu ustalonego reakcji enzymatycznej

5. Określanie szybkości początkowej reakcji enzymatycznej

6. Zmiany w stężeniach uczestników reakcji enzymatycznej w warunkach stanu stacjonarnego

7. Zmiany w stężeniach uczestników reakcji enzymatycznej w warunkach stanu przedstacjonarnego

8. Kinetyka reakcji enzymatycznej Model Michaelisa-Menten

9. KINETYKA REAKCJI MONOSUBSTRATOWYCH Równanie opisujące kinetykę reakcji można ułożyć przyjmując jedno z założeń: a. Założenie równowagi k2 << k-1 wprowadzając , oraz: v = k2 [E:S], jak również wiedząc, że na całkowite stężenie enzymu składa się stężenie enzymu wolnego oraz enzymu tworzącego kompleks z substratem, czyli: [Ec] = [E] + [E:S], otrzymuje się ostatecznie: , lub , gdzie kkat = k2 to stała katalityczna Ponieważ enzym działa z maksymalną szybkością V, jeżeli wszystkie jego cząsteczki tworzą kompleks z substratem, czyli gdy [E:S] = [Ec], to: V = kkat[Ec] Stała K obecna we wzorze opisującym zależność v = f([S]), wyprowadzonym przy przyjęciu założenia stanu r-gi nosi nazwę stałej substratowej i jest często określana symbolem Ks.

10. b. Założenie stanu ustalonego = 0; = k1 [E][S] – (k-1[E:S] + k2[E:S]) wprowadzając stałą i przekształcając równanie otrzymuje się: v = Stała K obecna we wzorze opisującym zależność v = f([S]), wyprowadzonym przy przyjęciu założenia stanu ustalonego nosi nazwę stałej Michaelisa - KM. Warto zauważyć, że KM = Ks + , czyli KM = Ks, jeżeli k2<<k1

11. GRAFICZNE METODY WYZNACZANIA STAŁYCH KINETYCZNYCH • Równanie Lineweavera-Burka

12. 2. Równanie Eadiego-Hofstee 3. Równanie Hanesa

13. Bezpośredni wykres liniowy

14. Znaczenie parametrów kinetycznych KM – stanowi miarę stężenia substratu wymaganego do osiągnięcia znaczącej szybkości reakcji; przy tym stężeniu połowa miejsc aktywnych jest obsadzona. Większość enzymów działa w warunkach, w których [S] jest bliskie KM lub nieco od niego mniejsze. Jeżeli KM jest bliskie Ks, to można uznać tą wartość za miarę powinowactwa enzymu do danego substratu. V - szybkość działania enzymu w warunkach pełnego wysycenia substratem, czyli gdy [S] >> KM. Stanowi miarę efektywności katalitycznej.

15. W warunkach fizjologicznych[S]/KM mieści się zwykle między 0,01 a 1,0. W tych warunkach tylko niewielka liczba miejsc aktywnych jest zajęta, a enzym działa z szybkością dużo mniejszą od V (czyli kkat). Prawdziwa jest przybliżona zależność: (przy czym [E]  [E]c) a stosunek kkat/KM jest miarą wydajności katalitycznej enzymu.

16. Znaczenie parametru (i) Określanie specyficzności enzymu wobec danego substratu podstawiając [Ec] = [E] + [E:S] i pamiętając, że , otrzymujemy i ostatecznie gdzie - pozorna drugorzędowa stała szybkości jeżeli [S1] = [S2], to

17. (ii) założenie stanu ustalonego, czy założenie równowagi? Z założenia stanu ustalonego: Jeżeli k2>>k-1, co jest ekstremalną formą założeń stanu ustalonego, to: , czyli: Jeżeli szybkość wiązania substratu jest kontrolowana dyfuzyjnie, to k1 109 M s-1 Jeżeli wartość jest tego rzędu, to założenie stanu ustalonego ma sens, natomiast, jeżeli << 109, to właściwsze jest założenie równowagi. Enzymy, dla których znajduje się pomiędzy 108-109 M-1s-1 osiągnęły perfekcję kinetyczną, tzn. ich szybkość katalityczna jest ograniczona wyłącznie szybkością dyfuzji substratów

18. KINETYKA REAKCJI DWUSUBSTRATOWYCH • Mechanizm tworzenia kompleksu • E + A + B  [E:A:B]  [E:P:Q]  E + P +Q • Kompleks może się tworzyć w sposób: • -uporządkowany (ordered binding) • E + A  [E:A] [E:A] + B  [E:A:B] E + B nie tworzą [E:B] • -przypadkowy (random binding) • E + A  [E:A] [E:A] + B  [E:A:B] • E + B  [E:B] [E:B] + A  [E:A:B] b. mechanizm ping-pong E + A  E + P E + B  E + Q

19. Mechanizm „ping-pong” Mechanizm reakcji katalizowanej przez karboksylazę pirogronianową szczawiooctan pirogronian

20. MODEL OGÓLNY WIĄZANIA KA i KB – stałe Michaelisa dla każdego z substratówprzy wysycających stężeniach drugiego substratu V – szybkość maksymalna przy wysycających stężeniach obu substratów RÓWNANIA KINETYCZNE - dla mechanizmu tworzenia kompleksu - dla mechanizmu ping-pong

21. OKREŚLANIE TYPU MECHANIZMU REAKCJI DWUSUBSTRATOWEJ NA PODSTAWIE DANYCH KINETYCZNYCH Dokonuje się pomiarów szybkości reakcji dla różnych wartości [A0] utrzymując stałe [B]. Powtarza się to dla kilku wartości [B]. Sporządza się wykresy w układzie Lineweavera-Burke’a. • Jeżeli otrzymuje się układ prostych przecinających się, to reakcja przebiega • z utworzeniem kompleksu Dla każdej linii określa się nachylenie i punkt przecięcia z osią 1/v Tworzy się wykresy wtórne

22. b.Jeżeli otrzymuje się układ prostych równoległych, to reakcja przebiega mechanizmem ping-pong Jedyny wykres wtórny:

23. HAMOWANIE REAKCJI ENZYMATYCZNYCH Stosując założenie stanu równowagi można wyprowadzić następujące równania ogólne: KES = KM; KEI = KI

24. HAMOWANIE REAKCJI ENZYMATYCZNYCH Założenie ograniczające: KESI = ; ES nie może łączyć się z I, a EI z S V= V; KM > KM Inhibicja kompetytywna

25. HAMOWANIE REAKCJI ENZYMATYCZNYCH Założenie ograniczające: KESI = KEI; wiązanie S nie wpływa na wiązanie I V< V; KM = KM Inhibicja niekompetytywna

26. HAMOWANIE REAKCJI ENZYMATYCZNYCH Założenie ograniczające: KEI = ; I łączy się tylko z ES V< V; KM < KM Inhibicja pozakompetytywna