Encimska kinetika - PowerPoint PPT Presentation

encimska kinetika l.
Download
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
Encimska kinetika PowerPoint Presentation
Download Presentation
Encimska kinetika

play fullscreen
1 / 20
Encimska kinetika
805 Views
Download Presentation
wind
Download Presentation

Encimska kinetika

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript

  1. Encimska kinetika • Obravnava hitrost, s katero se spreminjajo reaktanti (substrati S) v produkte (P): S → P • Hitrost podaja spremembo koncentracije substrata/produkta v časovni enoti (mol/s) V = -d(S)/dt = d(P)/dt • Hitrost encimske reakcije je merilo za aktivnost encima; enote za encimsko aktivnost: U = 1μmol/min ali katal (SI sistem) = 1mol/s • Specifična aktivnost encimskega pripravka: št. encimskih enot/mg roteina; enote za specifično aktivnost: μmol/min/mg A B • Masa proteinov (vse kroglice) je večja v čaši A kot v čaši B • Št. molekul encima je enako v obeh čašah – encimska aktivnost enaka v obeh čašah • Encimska aktivnost, izražena na mg proteinov (specifična aktivnost) je večja v čaši A • kot v čaši B

  2. Koncentracija substrata vpliva na hitrost encimske reakcije S → P V = -d(S)/dt = d(P)/dt V0 = ΔP/Δt v času t=0 Koncentracija substrata se s časom spreminja → začetna hitrost V0je hitrost v času t = 0 in je karakteristična za reakcijo v pogojih (S) >>> (E) ΔP Δt S4 >S3> S2> S1 → V04>V03>V02>V01

  3. Vpliv koncentracije substrata začetno hitrost encimske reakcije V0=k[S]1 – 1. red reakcije V0=k[S]0 – 0. red reakcije maksimalna hitrost Vmax Reakcijski pogoji: (S) > > (E) (S) je konstantna v času meritve Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005 Michaelisova konstantaKm

  4. Michaelis-Mentenova kinetika • Leonor Michaelis, Maud Menten 1912 • Ključnega pomena za encimsko katalizo je nastanek kompleksa ES • predpostavke • nastanek kompleksa ES je hitra reverzibilna • stopnja • razpad kompleksa ES je počasna reverzibilna • stopnja → razpad ES določa hitrost celotne reakcije • encim se nahaja v obliki kompleksa ES, • nasičen s substratom → saturacijska kinetika • 5. koncentracija kompleksa (ES) je konstantna – • stanje dinamičnega ravnotežja – “steady state”

  5. Opis krivulje V0 = V0(S) podaja Michaelis-Mentenova enačba Vpliv koncentracije substrata začetno hitrost encimske reakcije • Predpostavke pri izpeljavi • V zečetku je koncentracija P zanemarljivo majhna, ni reakcije • P → S (k-2 = 0) • Razgradnja ES določa hitrost celotne reakcije V0 = k2[ES] • Težko je izmeriti [ES] (V0 = V0([ES])), zato določimo Km in Vmax , • s katerima okarakteriziramo encimsko aktivnost

  6. nadaljevanje hitrost nastanka ES = hitrost razpada ES = hitrost nastanka ES = hitrost razpada ES Michaelisova konstanta Km Km = k2 + k-1/k1

  7. Vmax = k2Et Michaelis-Mentenova enačba

  8. Vpliv koncentracije substrata začetno hitrost – grafična določitev konstant Km in Vmax pri [S]<< Km pri [S]>>Km

  9. Transformacija Michaelisove enačbe v dvojno recipročno enačbo (Lineweaver-Burk-ova /LB/ transformacija) MM enačba LB enačba MM diagram V0 vs. [S] LB dvojni recipročni diagram 1/V0 vs.1/[S] uporaben za določitev Vmax in Km

  10. Vrednosti Km nekaterih encimov in substratov Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

  11. Pomen encimske aktivnosti v fiziologiji primer: občutljivost Azijcev na alkohol • Japonci in Kitajci dosežejo isti učinek alkohola (vazodilatacija, pospešen ritem srca...) že pri nižji koncentraciji zaužitega alkohola kot Evropejci • Reakcije razgradnje alkohola CH3CH2OH + NAD+→ CH3CHO + H+ + NADH encim: alkoholna hehidrogenaza CH3CHO + NAD+→ CH3COOH + H+ + NADH encim: aldehidna dehidrogenaza • Azijci nimajo izoencimske oblike encima aldehidne dehidrogenaze z nizko Km ; posledica: aldehid v krvi dolgo kroži po tekesu Izoemcimi: katalizirajo isto reakcijo (isti substrat), različne pa so molekulske lastnosti encimov: različna molekulska masa (Mr), različna encimska aktivnost (V0), različna MM konstanta (Km),

  12. Izražanje in primerjava katalitične učinkovitosti različnih encimov • Km • kkat • kkat/Km

  13. Izražanje in primerjava katalitične učinkovitosti različnih encimov, Km • Vmax , Km eksperimentalno določimo • Km odraža fiziološke razmere - za mnoge encime velja: Km ≈ [S] • Km je merilo za afiniteto E do s samo, če je = Kd = Če je Km, Michaelisova konstanta Kd, disociacijska konstanta kompleksa ES

  14. Izražanje in primerjava katalitične učinkovitosti različnih encimov, kkat • kkat = k3 • kkat - pretvorbeno število: št. molekul substrata, ki se pretvori v produkt na eni molekuli encima v enoti časa (encim je nasičen s substratom) Sprostitev produktov je pogosto najpočasnejša stopnja določa hitrost celotne reakcije Vmax = k3Et] Vmax – maksimalna hitrost k3 – hitrostna konstanta Et] – celokupna konc. encima

  15. Kinetična učinkovitost encimov: pretvorbeno število(turnover number), kkat Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005 Slabost: izražanje encimske učinkovitosti s Km ali kkat - ni upoštevana neencimska reakcija, ni informacije za koliko encim pospeši reakcijo

  16. Izražanje in primerjava katalitične učinkovitosti različnih encimov: kkat/Km Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005 Najboljši način za izražanje encimske aktivnosti - kkat/Km V0 =kkat/KmEt]S]

  17. Na encimsko aktivnost vplivajo zunanji pogoji • Vmax , Km – eksperimentalno določimo • Vmax , Km – karakteristični za encim • Vmax , Km – spreminjata se z zunanjimi pogoji - ionska moč - pH - temperatura Vpliv pH na encimsko aktivnost (V0) Vpliv T na encimsko aktivnost (V0) V0 glukoza-6-fosfataza pepsin

  18. Encimsko katalizirane bisubstratne reakcije - mehanizem Encimske reakcije, ki vključujejo ternarni kompleks Encimske reakcije, pri katerih ne nastaja ternarni kompleks (ping-pong mehanizem) Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005

  19. Primer bisubstrante reakcije: Prenos –NH2 skupine z enega na drug substrat; encimi: amino transferaze 1 Povišana koncentracija transaminaz (glutamat/oksaloacetat transaminaza (GOT) in glutamat/piruvat transaminaza (GPT)) v serumu kaže na - poškodbo srca (srčni infarkt/ poškodovano tkivo) - okvara jeter (zastrupitev z industrijskimi topili, infekcija Koencim: piridoksal-fosfat H2N- + O= ↔H2N- + O= ak, aminokislina kk, ketokislina ak1 + kk2 ↔ ak2 + kk1

  20. Kako ugotoviti mehanizem bisubstratnih reakcij? Kinetična analiza bisubstratnih reakcij Dvojni recipročni diagram potek reakcije preko ternarnega komleksa ping-pong mehanizem Nelson DL, Cox MM, Lehninger Principles of Biochemistry, 2005