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Enzimas – Parte 2. JANAINA DUARTE BAUMER SIANNAH MARIA MAS DIEGO Estágio em Docência Prof. Agenor Furigo Jr. Setembro/2008. Enzimas. Atividade enzimática Produção industrial de enzimas O processo fermentativo; Separação de enzimas intra e extracelulares; Purificação;

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Presentation Transcript
enzimas parte 2

Enzimas – Parte 2

JANAINA DUARTE BAUMER

SIANNAH MARIA MAS DIEGO

Estágio em Docência

Prof. Agenor Furigo Jr.

Setembro/2008

enzimas
Enzimas
  • Atividade enzimática
  • Produção industrial de enzimas
    • O processo fermentativo;
    • Separação de enzimas intra e extracelulares;
    • Purificação;
    • Controle de pureza;
    • Produto final.
atividade enzim tica
Atividade Enzimática
  • As medidas de [ ] em m/V, não tem aplicação para soluções enzimáticas
  • O que importa não é a massa, mas a atividade

Conserva a massa protéica

Proteínas desnaturadas

Sem atividade catalítica

atividade enzim tica1
Atividade Enzimática
  • Dosagem: através da medida de sua atividade

Avaliada pela velocidade da reação que a enzima cataliza ([S] ou [P])

uma amostra da solução contendo a enzima é incubada com [ ] de substratos (Vmáx.)

velocidade constante

Produto µmol/mL

Tempo (min.)

atividade enzim tica2
Atividade Enzimática
  • Dosagem: através da medida de sua atividade

Avaliada pela velocidade da reação que a enzima cataliza

uma amostra da solução contendo a enzima é incubada com [ ] de substratos (Vmáx.)

velocidade decresce

Produto µmol/mL

↓ [ ] de substrato:

-inativação parcial da enz.,

-inibição por produto.

Tempo (min.)

atividade enzim tica3
Atividade Enzimática
  • Dosagem: através da medida de sua atividade

Avaliada pela velocidade da reação que a enzima cataliza

uma amostra da solução contendo a enzima é incubada com [ ] de substratos (Vmáx.)

velocidade constante

Para evitar a influência destes fatores associar- se:

atividade medida da velocidade de reação em condição inicial (Veloc. Constante)

Produto µmol/mL

velocidade decresce

↓ [ ] de substrato: inativação parcial da enz., inibição por produto e deslocamento do equilíbrio (reação reversível).

Tempo (min.)

atividade enzim tica4
Atividade Enzimática
  • A velocidade da reação é medida e expressa em Unidades Internacionais (UI).

1 UI é a quantidade de enzima capaz de formar 1µmol de produto por minuto em condições ótimas

atividade enzim tica5
Atividade Enzimática
  • Métodos para a determinação da atividade de enzimas:
    • Conhecimento prévio da faixa de [ ] enzimática que permite obter uma variação linear da [P] (ou [S]) com o tempo.
    • Métodos para avaliar as [ ] das espécies:
      • Muito diretos: - Espectrofotometria, - Titulometria...
      • Menos diretos: - Medida da Viscosidade.
atividade enzim tica6
Atividade Enzimática
  • A medida da atividade enzimática é imprescindível para monitorar a purificação de uma enzima.
  • A atividade específica:

número de Unidades de enzima

miligramas de proteína

  • Portanto se a etapa de purificação for bem sucedida a atividade específica deve

Significa que o procedimento adotado eliminou proteínas indesejáveis.

atividade enzim tica7
Atividade Enzimática
  • Exemplo: Determinar a atividade de glicoamilase (hidrolisa o amido) em um caldo.

2 mL

8 mL: Solução de Amido (4%) a pH 4,2 e 60ºC

Caldo contendo a enzima

Após 10 min dosa-se glicose: 20 mg

20 mg em 10 min  2 mg/min ou 120 mg/h

A = 120/2 = 60 U/ml

atividade enzim tica8
Atividade Enzimática
  • Exemplo: Determinar a atividade de glicoamilase (hidrolisa o amido) em um caldo.

2 mL

8 mL: Solução de Amido (4%) a pH 4,2 e 60ºC

Caldo contendo a enzima

Após 10 min dosa-se glicose: 20 mg

20 mg em 10 min  2 mg/min ou 120 mg/h

A = 120/2 = 60 U/ml 1 mL - 60mg amido – 1 h

produ o industrial de enzimas
Produção Industrial de Enzimas
  • Fonte

Lípase Pancreática, Pepsina

Animais

Bromelina, Papaína

Vegetais

Lactase: S.fragilis,

Lipase: A.niger

Microrganismos

produ o industrial de enzimas1
Produção Industrial de Enzimas
  • A produção se faz majoritariamente por fermentação submersa
  • Nos países orientais há uma tradição estabelecida de utilização da fermentação semi-sólida.

Interessante para países que dispõem de resíduos agroindustriais - baixo custo

produ o industrial de enzimas2
Produção Industrial de Enzimas
  • Processo importantes prévios à fermentação

preparo do inóculo.

Pode-se partir de um cultivo em frasco agitado, inoculado com a cultura estoque liofilizada.

  • Decorrido o tempo suficiente, essa cultura é inoculada no fermentador principal.
  • Quantidade de inoculo: 1 a 10% (p/v)
  • A produção da enzima pode ser afetada por esse parâmetro.
produ o industrial de enzimas3
Produção Industrial de Enzimas

Linhagem microbiana

Sigilosamente protegida

Composição dos meios de cultivo

Quimicamente conhecidos (sintéticos)

Matérias-primas naturais

Fontes de carbono e energia, nitrogênio, substâncias minerais e fatores de crescimento

produ o industrial de enzimas4
Produção Industrial de Enzimas
  • Fermentadores
    • Mecanicamente agitados;
    • 10.000 a 100.000 litros;
    • Operados de modo descontínuo (batelada);
    • Munidos de camisas ou serpentinas internas para as necessidades de aquecimento e refrigeração;
    • Sistemas de medidas (sensores de pH, temperatura, oxigênio dissolvido e espuma);
    • As fermentações em batelada para produção de enzimas tem duração da ordem de 30 a a150 h.
produ o industrial de enzimas5
Produção Industrial de Enzimas
  • Processo a jusante (downstream) da fermentação
    • As operações que se seguem ao processo fermentativo
    • Dependem da localização da enzima de interesse

Intracelular

Extracelular

extra o enzimas extracelulares
Extração – Enzimas Extracelulares
  • O caldo é resfriado a cerca de 5°C,
    • Estabilidade do produto e
    • Evitar o crescimento de microrganismos contaminantes.
  • O pH é geralmente ajustado para o valor ótimo de atuação da enzima.
  • A separação das células

Centrifugação

Filtração

extra o enzimas extracelulares1
Extração – Enzimas Extracelulares

Solução clarificada contendo a enzima (livre de células)

Concentração

Ultrafiltração (utiliza a tecnologia de processos com menbranas)

Evaporação a vácuo (conduzida a T > 35°C)

extra o enzimas extracelulares2
Extração – Enzimas Extracelulares

Solução clarificada contendo a enzima (livre de células)

Concentração

Ultrafiltração (utiliza a tecnologia de processos com menbranas)

Esta solução diluída a níveis convenientes e acondiciona com estabilizantes da atividade enzimática pode ser embalada para comercialização.

Evaporação a vácuo (conduzida a T > 35°C)

extra o enzimas intracelulares
Extração – Enzimas Intracelulares

Caldo de Cultivo

Centrifugação

Romper as Células

Biomassa

extra o enzimas intracelulares1
Extração – Enzimas Intracelulares

Moagem com Esferas de Vidro

Homogeneização em Alta Pressão

Romper as Células

Tratamentos Enzimáticos

Sonificação

Tratamentos Químicos

extra o enzimas intracelulares2
Extração – Enzimas Intracelulares
  • A ruptura das células libera inúmeras substâncias para o meio aquoso

Ácidos Nucléicos

Precipitação

Mn II

Sobrenadante

Filtração

Ultrafiltração

Concentrado

Concentração à vácuo

purifica o
Purificação

Forma de apresentação e pureza

Concentrado Enzimático

Processo Iguais

purifica o1
Purificação

Forma de apresentação e pureza

Concentrado Enzimático

Processo Iguais

Forma sólida: seco a vácuo ou por atomização (spray drying)

diluída pode ser um produto comercializável

purifica o2
Purificação

Forma de apresentação e pureza

Concentrado Enzimático

Processo Iguais

Forma sólida: seco a vácuo ou por atomização (spray drying)

Peletizacao ou aglomeração

diluída pode ser um produto comercializável

Padronização da atividade com material sólido inerte

purifica o3
Purificação
  • Quando pretende-se obter uma preparação enzimática com > grau de pureza deve submeter-se a uma série de técnicas de fracionamento e purificação.

(NH4)2SO4

Concentrado Enzimático

Precipitação

Moléculas Proteicas

Centrifugação

purifica o4
Purificação
  • Quando pretende-se obter uma preparação enzimática com > grau de pureza deve submeter-se a uma série de técnicas de fracionamento e purificação.

solventes (etanol, metanol)

(NH4)2SO4

Concentrado Enzimático

Precipitação

Moléculas Proteicas

Centrifugação

purifica o5
Purificação
  • Quando pretende-se obter uma preparação enzimática com > grau de pureza deve submeter-se a uma série de técnicas de fracionamento e purificação.

solventes (etanol, metanol)

(NH4)2SO4

Concentrado Enzimático

Precipitação

ultrafiltração, microfiltração e osmose inversa

Moléculas Proteicas

Centrifugação

purifica o6
Purificação
  • Quando busca-se um alto grau de pureza do produto, técnicas cromatográficas são empregadas

Cromatografia de Troca Iônica

Carga das Moléculas

Cromatografia de partição ou de filtração em gel

Tamanho da Moléculas

Ligação bio-específica da enzima com os ligantes (substratos ou inibidores)

Cromatografia de Afinidade

purifica o7
Purificação
  • A concentração pode ser obtida das seguintes formas:

Purificação por Cromatografia

Concentração

Poros pequenos. Remove cerca de 70% da H2O

Adição de um polímero tipo Sephadex G-25

Remoção do solvente por membrana semi-permeável

Ultrafiltração

Remoção de água sob vácuo

Liofilização

purifica o8
Purificação
  • Controle de Pureza:
    • Eletroforese.
      • Técnica de separação de moléculas que envolve a migração de partículas com a aplicação de uma diferença de potencial
      • As moléculas são separadas de acordo com o seu tamanho, forma ou carga.
    • Das muitas técnicas de análise de proteínas, a eletroforese em gel é a + versátil e facilmente aplicável,
      • é tão sensível que se podem detectar proteínas que só diferem em um aa.
purifica o9
Purificação
  • O grau de purificação almejado esta relacionado à aplicação do produto. No mercado estão disponíveis:
      • Preparações pouco purificadas, para uso técnico ou industrial;
      • Preparados de alto grau de pureza para uso analítico ou farmacêutico.
produ o industrial de enzimas6
Produção Industrial de Enzimas

Caldo Fermentado

Enzima Intracelular

Enzima Extracelular

Separação sólido/líquido

Separação sólido/líquido

Rompimento Celular

Precipitação Ác. Nucléicos

Concentração

Concentração

Purificação

produ o industrial de enzimas7
Produção Industrial de Enzimas

Benefícios ambientais de trabalhar com enzimas:

- São produzidas de fontes renováveis.

- São completamente degradáveis.

- Propiciam economia de energia, água, (condições brandas de temperatura, pH e pressão minimizando a degradação térmica dos produtos finais).