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第二章 酶的生产 The production of Enzyme

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  1. 第二章 酶的生产The production of Enzyme

  2. 1、 提取法 (Extraction) 酶作为生物催化剂普遍存在于动物、植物、微生物中,可以直接从生物体中分离提纯而获得,早期酶的生产多是以动植物为主要原料提取而得。 例:胰脏——胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶; 动物胃——胃蛋白酶; 动物小肠——碱性磷酸酶; 木瓜——木瓜蛋白酶; 菠萝皮——菠萝蛋白酶; 柠檬酸发酵的废菌体——果胶酶 等。 一、酶的生产方法

  3. 利用动物、植物细胞和组织培养方法来生产酶,由于周期较长、成本较高,也存在一定难度。利用动物、植物细胞和组织培养方法来生产酶,由于周期较长、成本较高,也存在一定难度。 50年代以来酶生产的主要方法。 80年代以来,植物细胞或动物细胞发酵。 主要方式:固态发酵和液体发酵法 • 2、发酵生产法 (Biosynthesis)

  4. 1、氧化-还原酶 (1)葡萄糖氧化酶 (来源于霉菌) (2)D氨基酸氧化酶 (来源于霉菌、肾脏) (3)尿激酶 (来源于酵母菌、肾脏) (4)过氧化氢酶 (来源于细菌、霉菌、红血球) (5)近氧化物酶 (来源于植物) 2、转移酶 (1)转氨基酶 (来源于细菌、动物肝脏) (2)核苷磷酸转移酶 (来源于细菌) 3、水解酶脂肪酶 (来源于细菌、霉菌、胰脏)5`-磷酸二酯酶 (来源于霉菌)淀粉酶 (来源于细菌、霉菌、胰脏、麦芽)果胶酶 (来源于细菌、霉菌)纤维素酶 (来源于霉菌、蘑菇)半纤维素酶 (来源于霉菌)溶菌酶 (来源于细菌、鸡卵白)蜜二糖酶 (来源于霉菌)乳糖酶 (来源于细菌、霉菌)转化酶 (来源于细菌、酵母)透明质酸酶 (来源于细菌、动物睾丸)凝乳酶 (来源于霉菌、小牛胃、羊胃)天冬酰胺酶 (来源于细菌)脲酶 (来源于豆科植物)青霉素酰化酶 (来源于细菌、霉菌)氨基酰化酶 (来源于细菌、霉菌、牛肾脏)橙皮苷酶 (来源于霉菌)蛋白酶 (来源于霉菌、放线菌、动物内脏、植物瓜果)

  5. 4、裂合酶裂合酶 天冬氨酸-β-脱羧酶 (来源于细菌) β-酪氨酸酶 (来源于细菌) 延胡索酸酶 (来源于细菌) 谷氨酸脱羧酶 (来源于细菌) 5、异构酶 氨基酸消旋酶 (来源于细菌、霉菌、酵母) 葡萄糖异构酶 (来源于细菌、放线菌

  6. (1)酶的液体发酵生产一般过程 液体酶制剂生产流程图

  7. ①微生物种类多、酶种丰富; ②微生物生长繁殖快,酶易提取; ③微生物培养基来源广泛、价格便宜; ④酶发酵生产过程可实现规模化连续化。 (2)微生物产酶的优点

  8. 3、化学合成法: 60年代中期出现的新技术。 人工合成酶的方法 1969 年,美国首次用化学合成法得到含有124个氨基酸的核糖核酸酶。 要求氨基酸纯度高,合成成本高昂。至今停留在实验室阶段。 目前还受到试剂、设备条件的限制。

  9. 1、中心法则(Central Dogma ) Reverse transcription 二、酶的生物合成过程

  10. 在RNA的合成中,DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板,称为转录的不对称性。在RNA的合成中,DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板,称为转录的不对称性。 转录所需酶 依赖DNA的RNA聚合酶又称为转录酶。 原核生物的转录酶由1种RNA聚合酶催化所有RNA的生物合成。 真核生物中RNA聚合酶分别为RNA聚合酶Ⅰ、RNA聚合酶Ⅱ和RNA聚合酶Ⅲ3种,它们都属于寡聚酶,酶的亚基数目为4~10个,亚基种类有4~6种。 2、RNA的生物合成(转录)- Transcription

  11. 过程:RNA聚合酶 DNA启动基因,DNA双螺旋部分解开,以其中一条链为模板,通过碱基互补方式结合进入第一个核苷酸,然后,RNA聚合酶移动,DNA逐渐解开,按模板碱基顺序逐个加入核苷酸并聚合成多聚核苷酸链。转录成的RNA按结构和功能的不同分为mRNA,tRNA和rRNA。 RNA聚合酶

  12. 3、翻译: 以mRNA为模板,以氨基酸为底物,在核糖体上通过各种tRNA,酶和辅助因子,合成多肽。 分四个过程: A、氨基酸活化生成氨酰-tRNA B、肽链合成的起始 C、肽链的延长 D、肽链合成的终止

  13. A、氨基酸活化生成氨酰-tRNA 氨基酸在氨酰-tRNA合成酶的作用下,与特定的tRNA结合,由ATP供给能量;

  14. A A U C U A U A G Leucine Aspartic Acid Threonine AMINO ACIDS TRANSFER RNA

  15. A A U C U A U A G Leucine Aspartic Acid Threonine Amino acids combine with the tRNAs using the energy from the splitting of ADP.

  16. Aspartic Acid Threonine A A U C U A U A G Leucine Amino acids combine with the tRNAs using the energy from the splitting of ADP.

  17. Aspartic Acid Threonine A A U C U A U A G Leucine ANTICODON

  18. B、肽链合成的起始: 在GTP和起始因子参与下核糖体30S亚基、甲酰甲硫氨酰-tRNAF(fMet-tRNAF)、mRNA 和 50S亚基结合组成起始复合物。

  19. ①30S与起始因子IF3结合;②30S与mRNA结合形成30S- IF3-mRNA复合物;③fMet-tRNAF与起始因子IF2以及GTP结合; • 过程可分为五个阶段进行:

  20. ④在起始因子IF1的参与下,fMet-tRNAF -IF2-GTP与30S- IF3-mRNA结合生成30S起始复合物,fMet-tRNAF正好位于mRNA的起始密码子AUG上;

  21. ⑤50S与30 S起始复合物结合,形成具有完整结构的70S 核糖体。同时放出IF1 、IF2 、IF3并使GTP水解生成GDP和Pi;

  22. C、肽链的延长:在延伸因子的参与下,与mRNA上的密码子对应的氨酰-tRNA进入70S核糖体之中的“A”位。

  23. 通过肽合成酶的作用,P位上fMet-tRNAF的甲酰甲硫氨酰(fMet)与A位上的氨酰-tRNA(aa1-tRNA:)以肽键结合,形成肽酰-tRNA。

  24. mRNA和核糖体作相对移动,A位上的肽酰t-RNA转至P位,而原在P位上的t-RNAF游离出去。然后下一个氨酰-tRNA进入A位,再重复上述过程,使肽链不断延伸,直至终止密码子为止。mRNA和核糖体作相对移动,A位上的肽酰t-RNA转至P位,而原在P位上的t-RNAF游离出去。然后下一个氨酰-tRNA进入A位,再重复上述过程,使肽链不断延伸,直至终止密码子为止。

  25. D、 肽链合成的终止: 随着肽链的延伸,mRNA与70s核糖体不断地作相对移动。 • 当mRNA分子中的终止密码子(UAA,UAG,UGA)移动到核糖体的A位时,没有相应的氨酰-tRNA进入,此时释放因子(Release Factor)进入A位,并与终止密码子结合。

  26. 新合成的肽链释放出来需经过加工形成完整空间结构的酶或蛋白质。新合成的肽链释放出来需经过加工形成完整空间结构的酶或蛋白质。 先经过肽脱甲酰酶的作用,使甲酰甲硫氨酸残基上的甲酰基除去。 有时还需在氨肽酶的作用下从肽链的N-末端切除一个或数个氨基酸残基。 然后自动折迭弯曲成完整的空间结构。

  27. 三、酶生物合成的调节 雅各布(Jacob)和莫诺德(Monod)于1960年提出的操纵子学说来阐明酶生物合成的调节。 启动基因 Promoter gene 操纵基因 Operator gene 结构基因 Strutural gene 调节基因 Regulator gene 操纵子

  28. (1)基因调控模式 分解代谢物阻遏作用; 酶合成的诱导作用; 酶合成的反馈阻遏作用。 3种调控模式:

  29. 1 )分解代谢物阻遏作用 易利营养基质代谢使细胞内ATP浓度增加,从而使AMP浓度降低。cAMP可通过磷酸二酯酶水解成AMP致使cAMP的浓度之而降低。cAMP-CRP复合物的浓度跟着降低。结果,在启动基因(P)上没有cAMP-CRP复合物结合,RNA聚合酶也就无法结合到启动基因的位点上。结构基因(S)上的遗传信息无法转录,酶的合成无法进行。

  30. 当易利用基质不存在或用完后,随着细胞中ATP浓度的下降,而使ADP,AMP,cAMP的浓度增加。当cAMP-CRP的浓度增加到一定量的时候,cAMP-CRP复合物结合到启动基因的特定位点上,RNA聚合酶也随着结合到它的位点上,酶的生物合成就有可能进行。当易利用基质不存在或用完后,随着细胞中ATP浓度的下降,而使ADP,AMP,cAMP的浓度增加。当cAMP-CRP的浓度增加到一定量的时候,cAMP-CRP复合物结合到启动基因的特定位点上,RNA聚合酶也随着结合到它的位点上,酶的生物合成就有可能进行。

  31. 2)酶生物合成的诱导作用 无诱导物时,阻抑蛋白与操纵基因的结合较强,启动基因上的RNA 聚合酶无法进入结构基因上转录,酶不能合成。 有诱导物时,诱导物与阻抑蛋白结合,阻抑蛋白的结构改变,不能与操纵基因结合,RNA聚合酶可进行转录生成mRNA,再进一步翻译成酶蛋白多肽链。

  32. 3)酶生物合成的反馈阻遏作用 当没有共阻遏物(酶催化产物或途径的末端产物)时,阻抑蛋白不能与操纵基因结合,启动基因上的RNA聚合酶能顺利通过操纵基因位置,结构基因进行转录,进而合成酶蛋白多肽链。 当有共阻遏物时与阻抑蛋白特异结合形成完全阻遏物,与操纵基因的亲和力增强,阻止RNA聚合酶通过,结构基因无法转录,酶合成受阻。

  33. 四、酶生物合成的模式 细胞生长过程: 调整期、生长期、平衡期和衰退期等4个阶段 比较细胞生长与酶产生的关系, 酶生物合成的模式分为: 同步合成型、延续合成型、中期合成型和滞后合成型。

  34. 总细胞浓度 活细胞浓度 胞外酶浓度 胞内酶浓度 1、同步合成型 酶的生物合成与细胞生长同步进行。 酶的合成速度与细胞生长速度紧密联系,又称为生长偶联型。 属于该合成型的酶,细胞进入旺盛生长期时,酶大量生成;当细胞生长进入平衡期后,酶的合成随着停止。 大部分组成酶的生物合成属于同步合成型,有部分诱导酶也按照此种模式进行生物合成。 例如米曲霉在含有单宁或者没食子酸的培养基中生长,在单宁或没食子酸的诱导作用下,合成单宁酶(tanase EC3.1.1.20)。 酶 浓度 U/ml 细胞 浓度 mg/ml

  35. 2、延续合成型 酶的生物合成在细胞的生长阶段开始,在细胞生长进入平衡期后,酶还可以延续合成一段较长时间。 属于该类型的酶可以是组成酶,也可以是诱导酶。例如, 在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果胶为单一碳源的培养基中培养,可以诱导聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase,EC3.2.1.15)的生物合成。 酶 浓度 U/ml 酶 浓度 U/ml 细胞 浓度 mg/ml 细胞 浓度 mg/ml 以半乳糖醛酸为诱导物 以含有葡萄糖的果胶为诱导物

  36. 细胞 浓度 mg/ml 酶 浓度 U/ml 3、中期合成型 该类型的酶在细胞生长一段时间以后才开始,而在细胞生长进入平衡期以后,酶的生物合成也随着停止。 例如,枯草杆菌碱性磷酸酶(Alkaline phophatase,EC 3.1.3.1) 的生物合成模式属于中期合成型。由于该酶的合成受到其反应产物无机磷酸的反馈阻遏,而磷又是细胞生长所必不可缺的营养物质,培养基中必须有磷的存在。在细胞生长的开始阶段, 培养基中的磷阻遏碱性磷酸酶的合成,只有当细胞生长一段时间, 培养基中的磷几乎被细胞用完(低于0.01 mmol/L)以后,该酶才开始大量生成。又由于碱性磷酸酶所对应的mRNA不稳定,其寿命只有30 min左右,所以当细胞进入平衡期后, 酶的生物合成随着停止。

  37. 4、滞后合成型 此类型酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积累。又称为非生长偶联型。 许多水解酶的生物合成都属于这一类型。酶合成受到培养基中存在的阻遏物的阻遏作用。只有随着细胞的生长,阻遏物几乎被细胞用完而使阻遏解除后,酶才开始大量合成。 若培养基中不存在阻遏物,该酶的合成可以转为延续合成型。该类型酶所对应的mRNA稳定性很好,可以在细胞生长进入平衡期后的相当长的一段时间内,继续进行酶的生物合成。 22℃ 30℃ 酶 浓度 U/ml 酶 浓度 U/ml 细胞 浓度 mg/ml 酶 浓度 U/ml 不加 不加 加入 加入 放线菌素D 对产酶的影响 黑曲霉羧基蛋白酶生物合成

  38. mRNA稳定性好的,平衡期以后继续合成酶;不受阻遏物影响;生产中,最理想的合成模式应是延续合成型。mRNA稳定性好的,平衡期以后继续合成酶;不受阻遏物影响;生产中,最理想的合成模式应是延续合成型。 同步合成型要尽量提高其对应的mRNA的稳定性,为此适当降低发酵温度是可取的措施; 滞后合成型要设法降低培养基中阻遏物的浓度 ,尽量减少甚至解除产物阻遏或分解代谢物阻遏作用,使酶的生物合成提早开始; 中期合成型则要在提高mRNA的稳定性以及解除阻遏两方面下功夫,使其生物合成的开始时间提前, 并尽量延迟其生物合成停止的时间。 5、理想的酶合成模式

  39. 细胞生长动力学主要研究细胞生长速度以及外界环境因素对细胞生长速度影响的规律。1950年,法国的 Monod首先提出了表述微生物细胞生长的动力学方程。 6、酶生产过程中细胞生长动力学 在培养过程中, 细胞生长速率与细胞浓度成正比 。 假设培养基中只有一种限制性基质,而不存在其他生长限制因素时,μ为这种限制性基质浓度的函数。 KS 为Monod常数, 是指比生长速率达到最大比生长速率一半时的限制性基质浓度。

  40. 连续培养时的方程变化形式 限制性基质的物料平衡式

  41. 7、酶生产过程中产酶动力学

  42. 与生长相关 与生长部分相关 与生长无关

  43. 常用的几种模型

  44. 枯草杆菌:淀粉酶、蛋白酶; 巨大芽孢杆菌:葡萄糖异构酶; 大肠杆菌:谷氨酸脱羧酶、青霉素酰化酶等。 啤酒酵母:转化酶、醇脱氢酶; 假丝酵母:脂肪酶、转化酶; 黑曲酶:果胶酶、酸性蛋白酶、糖化酶; 根霉:糖化酶、转化酶; 毛霉菌:蛋白酶、糖化酶、脂肪酶; 青霉:纤维素酶、葡萄糖氧化酶; 米曲霉:糖化酶、蛋白酶; 链霉菌:青霉素酰化酶、碱性蛋白酶、几丁质酶。 五、酶的生产菌种

  45. 1、种子扩大培养 目的:为每次发酵罐的投料提供一定数量代谢旺盛的菌种。 种子扩大培养级数分为多级流程(一般三级):斜面菌种……摇床……一级种子培养------二级种子罐培养------发酵罐 六、酶的发酵生产工艺过程

  46. 2、发酵方法 (1)固体发酵法:

  47. (2)液体发酵法:

  48. (3)固定化细胞 (4)固定化原生质体

  49. 3、发酵工艺条件的控制(液体发酵为例) (1)pH值的调节 细胞产酶的最适pH通常接近于该酶反应的最适pH。 如:碱性蛋白酶最适pH为pH8.5-9.0;中性蛋白酶最适pH为pH6.0-7.0;酸性蛋白酶最适pH为pH4-6; 不同细胞需不同pH值;同一细胞不同pH值条件下产物也不一样. 黑曲霉中性时产α-淀粉酶多于产糖化酶,偏酸时产糖化酶提高而产α淀粉酶减少。

  50. (2)温度的调节: 产酶速度:分段控温。 产热因素:生物热+搅拌热-蒸发热-显热-辐射热 控制:冷却 (3)溶解氧的调节 N=KLα·C(C*-C) 影响:菌体生长;代谢途径 因素:菌体生长代谢;发酵异常(染菌:好氧杂菌、噬菌体;设备故障:加油器失灵、搅拌停止、温控失灵、空气管堵塞) 控制:供氧角度(罐结构L/D、搅拌、气体成分、通气速率、罐压);耗氧角度(基质浓度、温度、表面活性剂)。