Biotehnološka proizvodnja vitamina B12

1. Biotehnološka proizvodnja vitamina B12 Ivana Hrćan 129/09-F

2. Otkriće vitamina B12 • 1920.godine su dva američka lekara Džordž Mino i Vilijam Marfi pokazali da se smrtonosni oblici anemije mogu lečiti ishranom na bazi džigerice. • 1934.godine oni dobijaju Nobelovu nagradu kao pronalazači terapije protiv anemije. • 1964.godine naučnica Doroti Hodžkin dobija Nobelovu nagradu jer je uspela da utvrdi strukturu ove vrlo važne biohemijske supstance pomoću kristalografije X-zracima. • 1972.godine izvršena je potpuna sinteza vitamina B12.

3. Hemijska struktura vitamina B12 • B12 je jedan od hemijski najkompleksnijih vitamina. Njegova struktura se sastoji od korinskog jezgra za koji su vezana 4 prstena pirola. • U njegovoj građi se nalazi i druga prstenasta struktura-azotna baza 5,6-dimetilbenzimidazol (5,6-DMBI). • Centralni metalni jon je kobalt koji ima 6 koordinacionih veza. Četiri su zauzete pirolovim jezgrima, jedna sa azotnom bazom i poslednja ligandom R. • R=CN cijanokobalamin • R=CH3 metilkobalamin • R=OH hidroksikobalamin

4. Termin vitamina B12 ima dva značenja: • Širi smisao se odnosi na grupu jedinjenja koja sadrže Co-kobalamini: cijanokobalamin, hidroksikobalamin i dve koenzimske forme vitamina B12- metilkobalamin i 5-dezoksiadenozilkobalamin. • 2. U užem smislu, termin vitamin B12 se odnosi samo na cijanokobalamin koji se koristi u ishrani ili kao dodatak prilikom industrijske proizvodnje hrane. Zbog izuzetno kompleksne strukture, bilo je potrebno više od 10 godina saradnicima dve velike svetske laboratorije da izvrše hemijsku sintezu vitamina B12. Ova sinteza se sastojala iz 70 faza!!! Zbog toga se vitamin B12 danas dobija isključivo mikrobiološkim postupkom.

5. Fizičke i hemijske osobine vitamina B12 *Dobija se u obliku tamno crvenih igličastih kristala ili kao crveni amorfni prah; *Veoma je higroskopan u svojoj anhidrovanoj formi; *Stabilan je na visokim temperaturama samo pri pH od 4,5 do 5,5; *Gubi svoju aktivnost u jako kiseloj ili jako baznoj sredini; *Razgrađuje se na svetlosti i zato ga treba čuvati na tamnom mestu; *Stabilan je u sterilnom fiziološkom rastvoru i do godinu dana; *Neaktivan je, međutim, u organizmu se transformiše u aktivne oblike koji ispoljavaju dejstvo; *Dobro se rastvara u vodi i alkoholu a nerastvoran je u etru, acetonu i hloroformu. Optički je aktivan, skreće ravan polarizacije u levo;

6. Rasprostranjenost i biološka uloga vitamina B12 Vitamin B12 ne sintetizuju ni biljke ni životinje. Vitamin B12 sintetizuju samo neke vrste bakterija. Na primer, mikroflora preživara sintetizuje vitamin B12 u neophodnim količinama. Ima ga u mleku, jajima, žitaricama, ribama. Sadržaj ovog vitamina je u prehrambenim proizvodima mali, ali je njegov pravi izvor mikrobiološki.

7. Štiti od anemije pošto učestvuje u formiranju i regeneraciji crvenih krvnih zrnaca; • Povećava energiju organizma; • Obezbeđuje pravilan metabolizam belančevina, a posebno aminokiselina metionina, tirozina i triptofana; • Učestvuje u sintezi nukleinske kiseline; • Neophodan je za ispravno funkcionisanje ćelija centralnog nervnog sistema; • Potpomaže rast i razvoj; • Poboljšava koncentraciju, pamćenje i ravnotežu; • Predstavlja dobru zaštitu od kancera indukovanog pušenjem • Koristi se za lečenje: Jake anemije Ciroze jetre Nervnog i psihičkog rastrojstva

8. Avitaminoza Bolest uzrokovana hroničnom ili dugotrajnom vitaminskom deficijencijom. Poznato je, da nedostatak vitamina B12 u organizmu može izazvati nervne poremećaje i dovodi do megaloblastne anemije. Hipovitaminoza Nastaje usled nedovoljnog unošenja vitamina B12 u organizam. Ispoljava se u vidu sledećih simptoma: malaksalost, tahikardija, gubitak apetita,problemi sa probavom i depresija. Hipervitaminoza Nema mnogo dokaza o toksičnosti ovog vitamina, pre svega što se, ukoliko se unosi oralno, jako malo ovog vitamina apsorbuje. Međutim, ukoliko se vitamin B12 dobija intravenoznim injekcijama može doći do problema sa kožom. Ovaj vitamin se odstranjuje iz organizma u roku od 1-2 nedelje.

9. Preporučene dnevne doze • Delotvoran je u veoma malim koncentracijama. To su količine najmanje od svih do sada poznatih kod ostalih vitamina.Preporučene dnevne doze: • Odrasle osobe 2 mikrograma • Trudnice 2,2 mikrograma • Dojilje 2,6 mikrograma

10. Biosinteza vitamina B12 Aerobno Anaerobno Pseudomonas denitrificans Bacillus megaterium Propionobacterium shermanii Salmonella typhimurium

11. Biosinteza vitamina B12 se vrši isključivo u mezofilnim mikroorganizmima, tačnije u aerobnim i anaerobonim bakterijama. U početku se dobijao kao nusproizvod pri proizvodnji antibiotika streptomicina (Streptomyces griseus ) i hlor-tetraciklina (Sreptomyces aureofaciens). Zapaženo je da micelijum i profermentisana podloga kada se osuše imaju izvanredan uticaj na ishranu stoke. Prinos vitamina bio je 1-5 mg/kg osušene biomase. Streptomyces griseus Streptomyces aureofaciens

12. Biosinteza vitamina B12 primenom mikroorganizma Streptomyces olivaceus • Prva fabrika koja je bila otvorena u SAD-u radila je sa ovom mikroorganizmom. • Podloga: • 1% glukoze; • 4% vode od namakanja kukuruza ili neki drugi izvor azota; • 0,5% CaCO3; • Co treba dodati ukoliko ga podloga sadrži manje od 10 mg/l, međutim, koncentracija iznad 50 mg/l inhibira biosintezu; • Fe i Zn (1mg/l) bitni su za biosintezu; • Cu (do 10 mg/l) favorizuje rast i biosintezu; • Mo, Cr i Mg pomažu rast, ali nemaju uticaj na biosintezu.

13. Uslovi pri kojima se vrši umnožavanje: • umerena aeracija; • temperatura 27°C • Vitamin se pojavljuje u kasnoj fazi. • U micelijumu je od 60 do 80 sati. • Da bi se iz micelijuma izdvojio vitamin potrebno je: • centrifugiranje • zagrevanje sa kiselinom da se oslobodi vitamin • sušenje da bi se dobio koncentrat. • Prinos ovako dobijenog vitamina B12 bio je 3-5 mg/l Streptomyces olivaceus

14. Biosinteza vitamina B12 primenom propionskih bakterija • Najveće prinose daju bakterije propionske vrste Propionibacterium shermanii, P.freudenreichii, P.vennieli. • Podloga : • 5% glukoza; • 5% voda od namakanja kukuruza; • 0,4% KH2PO4; • 10 mg/l CoCl2 (prekursor) • 5 mg/l 5,6-dimetilbenzimidazol (dodaje se u 60-tom satu). • Procesni parametri: • pH=7,0 održava se dodatkom amonijaka jer se neprestano snižava tokom fermentacije; • 80-150 sati traje umnožavanje; • temperatura je 27°C; • umereno mešanje pomoću struje CO2.

15. Propionske bakterije su mikroaerofilne i proizvode vitamin B12sa zadovoljavajućim prinosom 15-50 mg/l u prisustvu neznatnih količina kiseonika. • Prva faza: • Prva 3 dana se proces fermentacije se vodi anaerobno u cilju proizvodnje kobamida, prekursora vitamina B12 kome nedostaje DMBI deo molekula. • Druga faza: • 1-3 dana uz umerenu aeraciju bakterije izvode aerobnu sintezu DMBI i vezuju ga za kobamid • Akumulirana propionska kiselina se mora neutralisati a pH se mora održavati na 7 tokom fermentacije. Podlozi se dodaje i kukuruzni ekstrakt koji sadrži mlečnu i pantotenskukiselinu koje povećavaju rast bakterija. Pantotenska kiselina stimuliše biosintezu vitamina pa se preporučuje da se dopunski unosi u podlogu. Stimulatino dejstvo na biosintezu vitamina B12 propionskim bakterijama ima amonijum jon, a u njegovom odsustvu NE dolazi do sinteze.

16. Biotehnološka proizvodnja vitamina B12 primenom Pseudomonas denitrificans Pseudomonas denitrificans je prvi put izolovan 1960.god. Početna produktivnost vitamina je bila 0,6 mg/l a postepeno je povećana na 60 mg/l Podloga : 1.Melasa (100 g/l) iz šećerne repe je najbolji izvor ugljenih hidrata jer sadrži 5-10% betaina koji stimuliše dobijanje vitamina. 2. Ekstrakt kvasca (2 g/l) 3. (NH4)2SO4 (5 g/l) 4. MgSO4 (3 g/l) 5. MnSO4 (0,2 g/l) 6. CoNO3 (0,188 g/l) 7. 5,6-DBA (0,25 g/l) 8. ZnSO4 (0,20 g/l) 9. NaNO3 (0,5 g/l) 10. Česmenska voda

17. Proizvodnja vitamina B12 korišćenjem Pseudomonas deutrificans se odvija u aerobnim uslovima. Aeracija se vrši tokom čitavog fermentacionog perioda, 2-3 dana. pH vrednost mora biti između 6-7. Biosinteza vitamina B12primenom metanogenih bakterija U proizvodnji se koriste združene kulture termofilnih i metanskih bakterija. Metanske bakterije su striktni anaerobi. Kao supstrat za metansku fermentaciju služi džibra acetobutilne i alkoholne femnetacije što je jeftina sirovina pa je postupak ekonomičan. 0,5% v/v metanola povećava prinos B12. Prinos je 4,0-5,0 mg/l vitamina.

18. Usavršavanje sojeva • Povećanje prinosa cijanokobalamina danas se vrši usavršavanjem sojeva: • Mutacijom • Selekcijom • Genetičkim inženjerstvom • Ovim metodama je i do 50 puta povećana produktivnost sojeva Pseudomonas denitrificans

19. Izolovanje vitamina B12 Po završetku fermentacije se dobija smeša više hemijskih formi vitamina B12. U industriji se ne izdvaja svaka forma ponaosob već se vrši konverzija svih kobalamina u cijanokobalamin tretiranjem sa cijanidom. Konverzija se vrši u profermentisanoj podlozi zajedno sa ćelijama ili u separisanoj vodenoj suspenziji koja sadrži ćelije. T= 80-120 °C pH=6,5-8,5 Vreme 10-30 min Dolazi do hidrolize ćelijskih zidova i oslobađanja različitih kobalamina. Taj rastvor se tretira zatim sa KCN. Smeša se filtrira ili tretira cink-hloridom Vitamin se taloži dodatkom sredstva za taloženje (tanin ili krezol)

20. Dobijeni proizvod je čistoće oko 80% i kao takav se može koristiti kao dodatak stočnoj hrani. Za dobijanje visoko prečišćenog proizvoda koriste se organski rastvarači: krezol, ugljen-tetrahlorid ili smeša vode i butanola) Vrši se adsorpcija na jonoizmenjivačke smole ili pomoću aktivnog uglja. Vitamin B12 kristališe dodatkom organskog rastvarača pri čemu se dobija kvalitet potreban za farmaceutsku industriju ili kao dodatak ljudskoj hrani.

21. BIOTEHNOLOŠKA ŠEMA Biomasa kulture Propionibacterium shermanii Zagrevanje 80-120ºC 10-30 min. kristali B12 biomasa dodatak KCN aktivni ugalj filtrat sirovi B12 B12 na aktivnom uglju eluacija smešom aceton:voda 1) ekstrakcija smešom rastvarača aceton:voda 2) uparavanje acetona hromatografija na koloni (SiO2 gel, Amberlite x AD,Al2O3) organski ekstrakt vodeni ekstrakt ekstrakcija smešom rastvarača fenol:CCl4

22. Određivanje vitamina B12 • HPLC sa UV detekcijom • HPLC sa elektrohemijskim detektorom • Spektrofotometrija sa UV detekcijom • Radioimunološka metoda • Mikrobiološka identifikacija

23. Literatura: 1. Mojović, Lj (2008): Farmaceutska biotehnologija Tehnološko-metalurški fakultet, Beograd 2. Pejin, D (2003): Industrijska mikrobiologija, Tehnološki fakultet, Novi Sad 3. Internet 4. Prezentacije prethodnih generacija.